[發明專利]肝癌相關基因DLK1及其應用

無效

• 申請號: 200610119409.0
• 申請日: 2006-12-11
• 公開（公告）號: CN101200719A
• 公開（公告）日: 2008-06-18
• 發明（設計）人: 韓澤廣;黃健;張新
• 申請（專利權）人: 上海人類基因組研究中心
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;A61K48/00;A61K31/7088;A61P35/00;C12Q1/68
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司
• 代理人: 丁紀鐵

技術領域

本發明涉及分子生物學和基因工程領域，具體地，本發明涉及肝癌相關基因DLK1、以其mRNA序列為靶點的一組siRNA、及其在制備診斷肝癌試劑、制備基因治療肝癌的藥物中的應用。

背景技術

目前我國有慢性肝炎患者約1200萬例，每年死于肝病約30萬，其50％為原發性肝癌，約占全世界肝癌死亡人數的45％左右。絕大多數與HBV、HCV感染有關。肝癌發病率在我國居2-3位，主要在青壯年男性發病，在華東地區的發病率明顯高于其他地區，近年來，有持續上升趨勢。在上海，肝癌的發病率居第三位，僅次于肺癌和胃癌。最新資料顯示這個比例還有繼續上升的趨勢?，F在，肝癌，特別是肝炎病毒引起的肝癌已經嚴重危害了我國人民生命安全。因此，非常有必要對肝癌發生的分子機制作深入的研究。

隨著人類基因組測序的完成，基因組學的研究重點已經轉移到以解析基因功能為主的功能基因組學研究。功能基因組學的重點是以疾病為中心，全力解決人類疾病相關基因研究中的重大科學問題。肝癌在我國素有“國病”之稱，經過半個世紀的探索，對于肝癌的早期診斷和治療雖然有了一定的認識，但肝癌預后仍然很差，特別是對其發病機制的了解及治療藥物的新靶點方面，更是知之甚少。因此，尋找與腫瘤相關的基因，特別是尋找新的抑癌基因是近年來腫瘤研究的熱點。DLK1基因定位于染色體14q32上。DLK1是在胞外區域包含6個EGF樣重復序列的糖基化Delta樣跨膜蛋白。DLK1首先是在脂肪前體細胞中發現，與脂肪細胞的分化緊密相關。DLK1基因具有抑制脂肪前體細胞向脂肪細胞分化的功能。近年來，有研究發現DLK1在神經母細胞瘤細胞和小細胞肺癌細胞株等腫瘤細胞中存在表達，表明DLK1基因可能與腫瘤發生相關；同時在老鼠的胎肝細胞和膽汁淤積引起的肝纖維化細胞中均發現DLK1的表達。在我們的前期肝癌及癌旁表達譜分析的研究中，發現DLK1基因在肝癌中的表達較癌旁組織中明顯增加，提示DLK1基因可能對肝癌的發生相關。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種肝癌相關基因DLK1的mRNA序列，蓋基因定位在人染色體14q32上，可用于制備治療原發性肝癌的RNA干擾藥物。

為解決上述技術問題，本發明提供肝癌相關基因DLK1的mRNA序列。

本發明還提供一種表達載體，含有所述以DLK1上mRNA為靶點的siRNA序列。

本發明還提供一種含有所述表達載體的宿主細胞。

在本發明的再一方面，還提供了一種用于治療肝癌的試劑盒，其含有所述的以DLK1上mRNA為靶點的siRNA。

在本發明的又一方面，還提供了一種用于治療肝癌的生物芯片，其含有以DLK1上mRNA為靶點的siRNA。

在本發明的又一方面，還提供了肝癌相關基因DLK1在制備診斷肝癌及腫瘤的試劑，和制備基因治療肝癌及腫瘤的藥物中的應用。

本發明由于對DLK1基因進行了體外動物細胞試驗，證實DLK1缺失能夠導致肝腫瘤細胞顯著縮小，認為DLK1基因在進行制備治療肝癌的基因藥物中有巨大作用，可以成為基因治療的靶點。

附圖說明

圖1是實施例1中pSUPER?DLK874和pSUPER?DLK1011的RNA干擾效率示意圖，其中，pSUPER為空載對照，pSUPER?Luc+為陰性對照；

圖2是實施例2中三次克隆實驗中的一次的實驗照片；

圖3是實施例2中從上到下為Hep3B、HepG2和Huh-7細胞在三次獨立實驗中的克隆數目統計圖，其中，*表示與對照組比較時p值＜0.05；

圖4是實施例3中DLK1表達穩定下調的Huh-7細胞株的鑒定示意圖，其中，β-actin作為各樣品蛋白上樣量對照；

圖5是實施例3中DLK1表達穩定下調Huh-7細胞株的生長曲線比較示意圖，其中，細胞活力在450nm波長處測量，每點上下所標的黑色刻度線標志為其標準差；

圖6是實施例4中DLK1表達下調的Huh-7細胞在裸鼠體內的成瘤性降低示意圖；上圖為4周后攜帶腫瘤的裸鼠照片，皮下的腫瘤呈圓塊狀；下圖為4周后取下的皮下腫瘤照片，其中Huh-7?p1011?A4細胞在六周后仍無腫瘤形成；

圖7是實施例5中SMMC-7721瞬間轉染pcDNA3.0和pcDNA3.0-DLK1后的生長曲線示意圖；