[發(fā)明專利]重組惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白及其制法和用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200610118947.8
• 申請(qǐng)日: 2006-12-01
• 公開（公告）號(hào): CN101190946A
• 公開（公告）日: 2008-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘衛(wèi)慶;張青鋒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;A61K48/00;A61K38/16;A61P33/06;C12P21/02
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 徐迅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)和基因工程疫苗領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種源自惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的重組蛋白；編碼所述重組蛋白的DNA序列；含所述DNA序列的載體；含所述載體的宿主細(xì)胞；含所述重組蛋白的疫苗；用基因工程制備該重組蛋白的方法；以及該重組蛋白在制備抗瘧疾疫苗方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)

瘧疾是人類最古老的傳染病之一，目前仍嚴(yán)重影響人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的最新調(diào)查，約世界人口的40％仍處在瘧疾威脅之中，分布于100多個(gè)國(guó)家。目前世界上每年有3至5億人罹患瘧疾，其中約300萬(wàn)人死亡。更為嚴(yán)重的是，由于瘧原蟲及蚊媒抗藥性的產(chǎn)生和迅速擴(kuò)散，瘧疾不僅沒(méi)有得到有效控制，反而有卷土重來(lái)之勢(shì)。因此，開展全球遏制瘧疾計(jì)劃已成為WHO在新世紀(jì)兩個(gè)重點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。

人們?cè)诏懠卜乐沃幸揽炕蚱谕@得突破的主要有三個(gè)途徑：抗瘧藥、瘧疾疫苗和蚊媒防制。但抗瘧藥及蚊媒防制面臨著巨大的困難和挑戰(zhàn)，這是因?yàn)榀懺x及蚊蟲抗藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散。盡管目前尚未有應(yīng)用價(jià)值的瘧疾疫苗問(wèn)世，但普遍認(rèn)為發(fā)展瘧疾疫苗是人類控制乃至消滅瘧疾的重要途徑。

大量研究表明，瘧疾是可以通過(guò)研制有效的疫苗而實(shí)現(xiàn)預(yù)防的。如用滅活子孢子免疫的志愿者能完全保護(hù)后來(lái)的攻擊感染。再如用鼠瘧原蟲的重組抗原免疫小鼠，亦能完全保護(hù)后來(lái)同種瘧原蟲的攻擊感染。此外，瘧疾流行病學(xué)研究也顯示，死于瘧疾的主要是無(wú)瘧疾免疫力的人群，如：在瘧區(qū)的兒童和非瘧區(qū)人群進(jìn)入瘧區(qū)，而在瘧區(qū)的成人很少因瘧疾而死亡。如給這些無(wú)免疫力的人群接種有效的疫苗，使其達(dá)到與瘧區(qū)成人同樣的免疫力，這樣就能實(shí)現(xiàn)預(yù)防瘧疾和降低瘧疾死亡率的目標(biāo)。因此，瘧疾疫苗研制已成為當(dāng)今世界性熱點(diǎn)課題。

瘧疾疫苗的研究已進(jìn)行了20多年，但至今仍無(wú)可應(yīng)用的有效瘧疾疫苗問(wèn)世。目前正在研究開發(fā)的瘧疾疫苗有3種，即：抗子孢子疫苗，紅內(nèi)期疫苗和阻斷傳播的疫苗。然而，這些疫苗均因?yàn)樾ЯΦ拖隆⒊掷m(xù)時(shí)間短、或不穩(wěn)定等原因，應(yīng)用受到限制。

此外，研制由瘧原蟲紅外期和紅內(nèi)期等抗原組成的多價(jià)多期疫苗是瘧疾疫苗研發(fā)的趨勢(shì)。本申請(qǐng)人已經(jīng)研制了含有主要裂殖子表面抗原(MSP1)和裂殖子頂端膜抗原(AMA-1)的融合蛋白的疫苗(也稱為PfCP-2.9)，其是一種紅內(nèi)期瘧疾疫苗。為提高疫苗的免疫保護(hù)效力，需要尋找合適的紅外期抗原與其聯(lián)合應(yīng)用，以達(dá)到全面且良好的防治瘧疾的效果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是提供源自惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的重組蛋白。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種重組蛋白，所述重組蛋白具有以下結(jié)構(gòu)：

元件B-連接肽-元件A；或

元件A-連接肽-元件B；

其中，

元件A為惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的C端免疫區(qū)；

元件B為無(wú)，或惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白中除C端免疫區(qū)以外的免疫反應(yīng)表位區(qū)域；

連接肽為無(wú)，或長(zhǎng)度為1-30氨基酸的肽，所述的連接肽對(duì)于元件A和元件B的構(gòu)象基本上無(wú)影響。

并且，所述的重組蛋白不具有惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的氨基酸序列，更優(yōu)選的，所述的重組蛋白不具有SEQ?ID?NO：8所示的氨基酸序列。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的C端免疫區(qū)是惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白中位于中心重復(fù)區(qū)與錨定區(qū)之間、且不包括中心重復(fù)區(qū)與錨定區(qū)的氨基酸序列。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的C端免疫區(qū)包括：惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白第二區(qū)域(RII區(qū)域)和C-末端內(nèi)的T、B細(xì)胞表位。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在所述元件A的氨基酸序列中，消除了糖基化位點(diǎn)的氨基酸序列。更優(yōu)選的，將所述的惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白的第382位的Asn轉(zhuǎn)變?yōu)锳la，從而消除糖基化位點(diǎn)。

更佳地，所述的元件A具有SEQ?ID?NO：2中第5-116位的氨基酸序列。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，除了連接、克隆、表達(dá)或純化相關(guān)位點(diǎn)以外，所述重組蛋白上的其它區(qū)域均來(lái)源于惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述元件B是惡性瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白中心重復(fù)區(qū)的部分或全部的氨基酸序列。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的中心重復(fù)區(qū)的氨基酸序列為：(NANP)_n，其中，n＝3-34。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的中心重復(fù)區(qū)的氨基酸序列為：(NANP)₁₅。