[發明專利]細胞內含有巨大葉綠體的轉基因植物細胞系、及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 200610113810.3
• 申請日: 2006-10-18
• 公開（公告）號: CN101165175A
• 公開（公告）日: 2008-04-23
• 發明（設計）人: 何奕昆;胡勇;王東;孔冬冬
• 申請（專利權）人: 首都師范大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/82;C12N15/29
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，具體地，本發明涉及一種細胞內含有巨大葉綠體的轉基因細胞系及其制備方法和應用。

背景技術

利用植物生物反應器生產口服疫苗已成為目前研究的熱點。與傳統疫苗相比，植物源性疫苗具有安全、穩定、高效的特點。隨著生物技術的不斷完善，植物生物反應器將會成為疫苗生產的有效途徑，并部分替代傳統疫苗的生產方式。

葉綠體基因組轉化由Boynton等20世紀80年代末首次在單細胞植物衣藻中獲得成功，之后多家實驗室轉化高等植物葉綠體獲得成功，近年來的研究取得了突破進展，并成為國際植物生物技術研究的一個熱點，尤其是有關葉綠體轉化的高效表達特性的報道，使其在植物生物反應器的應用日益受到重視

與常規外源基因核轉化相比，葉綠體具有獨特優點：基因區域化高效表達、母性遺傳避免轉基因花粉傳播、生物安全性高、不會產生基因沉默現象、可直接表達原核基因、產物區域化、可高效表達外源基因、以及利于同時進行多基因的轉化等等。因此，植物葉綠體基因工程越來越引起人們的廣泛關注。目前該技術主要應用于：葉綠體作為生物反應器生產疫苗等醫藥蛋白；獲得抗蟲、抗病、抗除草劑和耐旱的轉基因植物。

但是，植物葉綠體轉化也存在明顯的不足，高等植物細胞約有50-200個葉綠體，葉綠體轉化經過抗性篩選得到的植株一般是異質的(heteroplasmic)，即轉化和未被轉化葉綠體同時存在于轉基因植株。這種雜合體遺傳不穩定，目的基因表達產量不高。然而，獲得同質化(homoplasmic)轉基因植株正是葉綠體轉化相對于常規細胞核轉化的主要困難。因此，必須設法使轉基因植株達到同質化(homoplasmic)狀態。國內自90年代初期開展葉綠體遺傳轉化工作以來，已將編碼氨基糖苷3′腺苷酸轉移酶的aadA基因以及編碼PPT(Phosphinothricin)乙酰轉移酶的bar基因、編碼蘇云金芽孢桿菌晶體毒蛋白的Bt基因^]和人丙肝病毒融合抗原基因NS3C等成功地導入到高等植物的葉綠體基因組中，有些外源基因已獲得表達。但分子檢測表明，幾乎所有轉基因植株均未能達到完全同質化狀態^]。如何才能快速獲得同質化葉綠體轉基因植株，已成為長期困擾我們而且也是亟待解決的難題。

外源基因向葉綠體基因組中的整合是通過同源重組實現的。關于如何提高同源重組的效率以及提高轉化率和轉基因株系的同質化程度，國外已有一些文獻對此進行了報道。主要有如下幾種方法：

(1)在轉化前設法降低受體細胞中葉綠體DNA的含量。這可以通過使用DNA損傷試劑(DNA?damaging?agents)或用葉綠體DNA合成抑制劑處理受體細胞來實現。Boynton等報道在基因槍轉化前，將受體細胞(Chlamydomonas?reinhardtii)用5mmol/L的5氟脫氧尿苷(FdUrd，5?fluorodeoxyuridine)處理，使其葉綠體基因組的數量減少5-7倍，可使轉化效率提高20-280倍^]；Kindle等用0.5mmol/L的FdUrd處理衣藻細胞，并將其置于弱光(0.1w/m2)下培養一段時間再進行轉化，也得出了相似的結論；Ye等報道，用DNA促旋酶抑制劑(200mmol/L萘啶酮酸或30mmol/L新生霉素)處理受體細胞(Solanum?nigrum)，可有效降低葉綠體DNA的含量，從而可用于提高高等植物葉綠體轉化效率和同質化程度。

(2)紫外照射法：轉化前，將受體細胞用低劑量(1.7×105ergs/cm2)的UV(＜280nm)短暫照射，可將轉化率提高4倍。紫外照射可促進藍細菌轉化過程中外源序列的整合。

(3)野生型E.coli?recA基因介導法：Cerutti等的研究結果表明，野生型E.coliRecA蛋白可使葉綠體DNA同源重組的頻率提高15倍^]。因此，將E.coli?recA基因導入葉綠體基因組中，可以提高DNA分子的重組頻率從而提高轉化子的同質化水平。