[發明專利]從中藥中篩選胰脂肪酶抑制劑的方法

有效

• 申請號: 200610111692.2
• 申請日: 2006-08-22
• 公開（公告）號: CN101131389A
• 公開（公告）日: 2008-02-27
• 發明（設計）人: 薛蓮;洪孟學;于軍平;汪家權;殷秀飛;廖玉華;胡柳;柴嬰蕾;馮芳;余琴芳;趙民軍;周天浩
• 申請（專利權）人: 浙江養生堂天然藥物研究所有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N21/64;C12Q1/25
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 唐偉杰

技術領域

本發明涉及從中藥中篩選胰脂肪酶抑制劑的方法。

背景技術

肥胖是指由于能量攝入超過消耗，導致體內脂肪積聚過多而造成的疾病。據世界衛生組織統計：全球肥胖癥患者達3億人，其中兒童占2200萬人，11億人體重過重。肥胖與多種疾病的發生相關，是糖尿病、心腦血管病、高血壓、胰島素抵抗、膽結石、某些癌癥的危險因素，此外，由此帶來的健康問題還包括生殖與性功能障礙、負重關節的疾病、精神失常、意外傷害。因此，肥胖已成為全球性的公共衛生問題。隨著肥胖發病率的日益增高，迫切需要新的、有效的且安全的治療手段幫助肥胖患者減輕并進一步維持體重，同時降低與肥胖相關的心血管疾病方面的危險因素。

目前國際上減肥藥物的開發主要依據兩個原理：抑制食欲和減少脂肪吸收。其中，后者可以在維持正常飲食的前提下達到控制體重的目的。來自飲食的脂肪酸有50％-70％是通過胰脂肪酶的水解作用產生的^[1]，因此胰脂肪酶在脂肪的吸收方面具有重要的作用。胰脂肪酶抑制劑能通過減少飲食中的脂肪吸收，減少人體的熱量攝入，達到控制體重的目的，并進一步減少與肥胖伴發的疾病危險因素發生的可能性。這類藥物的代表產品是賽尼可，這類產品可以抑制大約30％攝入脂肪的吸收。

[1]F?Carriere，J?A?Barrowman，R?Verger?et?al.Secretion?andcontribution?to?lipolysis?of?gastric?and?pancreatic?lipasesduring?a?test?meal?in?human[J].Gastroenterology，1993，105(3)：876-88

中藥是以中醫理論為基礎，用于防治疾病的物質的總稱，其來源有植物藥、動物藥、礦物藥。中藥具有二千多年臨床用藥歷史，是人類經過了自身長期的篩選所積累的寶貴資源。研究表明，一個單味中藥的化學成分數以百計，中藥是一個數量龐大，資源豐富的天然的混合化合物庫。但中藥往往成分復雜，作用機理不明確。基于胰脂肪酶對于脂肪吸收的重要性，通過建立胰脂肪酶抑制劑篩選模型，以中藥提取物庫為對象進行篩選，是開發療效明確、機理清楚的減肥新藥的一條可行途徑。

發明內容

本發明的目的是提供用于從中藥中篩選胰脂肪酶抑制劑的篩選方法。

因此，本發明涉及一種從中藥中篩選胰脂肪酶抑制劑的方法，其包括：

a.將胰脂肪酶采用固相包被方法包被在酶標板上；

b.洗滌后加入活化劑孵育一定時間使酶活化；

c.洗滌后加入中藥提取物樣品孵育一定時間；

d.洗滌后加入底物試鹵靈甘油酯反應一定時間，利用酶標儀測定反應一定時間后生成的終產物試鹵靈(resorufin)的熒光強度，該產物具有熒光，EX＝572nm，EM＝590nm，通過與對照孔熒光強度的對比，計算樣品對胰脂肪酶的抑制率。

與常規的均相篩選方法比較，本發明采用固相包被和加樣孵育后進行洗滌的方法，可大大減少假陽性結果的產生。例如，避免樣品對底物影響造成的假陽性。具體講，在胰脂肪酶催化脂類底物水解時，其通過吸附在乳化底物的脂-水界面上改變了自身的結構，從無活性的關閉構象轉變為具有催化活性的開放構象，酶的催化位點暴露出來與底物結合。采用常規的均相篩選方法時，當體系中存在具有表面活性的物質時，這些物質覆蓋在底物表面，妨礙了胰脂肪酶吸附到脂-水界面，最終導致底物水解的減少。這類具有表面活性的物質在中藥提取物中廣泛存在，如皂苷、長鏈脂肪酸等，會造成假陽性的篩選結果。同時也可減少樣品對酶反應干擾造成的假陽性。具體講，中藥樣品的特點是成分、濃度都不明確。在常規的均相篩選體系中樣品中存在的多種物質可能通過非特異吸附、自身熒光對檢測結果的干擾等因素導致陽性結果。采用固相包被方法，將樣品與固定化的酶孵育一定時間后洗滌，可以除去不與酶結合或與酶結合力弱的物質，從而減少對酶反應的影響，減少假陽性。

進一步講，本發明除了可以應用在胰脂肪酶抑制劑的篩選之外，對脂蛋白脂酶、磷脂酶等作用于非水相底物的脂水解酶，由于它們普遍存在界面活化的催化特性，因此本發明對建立這類酶抑制劑篩選模型具有指導意義。

附圖說明

圖1胰脂肪酶SDS-PAGE電泳圖譜(箭頭處為純化樣品)

圖2均相反應體系中胰脂肪酶的標準曲線

圖3不同酶包被濃度下的反應結果

圖4TT對酶反應的影響

圖5陽性對照賽尼可在酶的活化與非活化狀態下對酶反應的抑制