[發明專利]無機磷診斷/測定試劑盒及無機磷濃度的測定方法

無效

• 申請號: 200610097315.8
• 申請日: 2006-10-30
• 公開（公告）號: CN101173938A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/84
• 分類號: G01N33/84;G01N21/78;G01N21/25;C12Q1/32;C12Q1/00
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技術領域

本發明涉及一種無機磷診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定無機磷濃度的測定方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。

背景技術

人體內磷的87％都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動態平衡，血中鈣、磷濃度之間有一定關系，正常人血鈣升高則血磷降低，反之亦然。血漿中[鈣]、[磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每100毫升血漿鈣磷濃度的乘積為35——40。當二者乘積大于40時，鈣和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，＞70時，可發生轉移性鈣化。當乘積＜35時，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成骨作用，引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、[Pi]的恒定，主要受維生素D，甲狀旁腺激素及降鈣素的調節。

由于人體的磷目前還不能直接測定，所以無機磷的檢測實際上是分析磷酸鹽陰離子(H₂PO₄^1-，HPO₄^2-)。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原法，染料結合法，酶法，同位素稀釋質譜法、原子吸收分光光度法和流動注射分析法等。決定性方法是同位素稀釋質譜法，WHO推薦的中等實驗室測定無機磷的常規方法是比色法。

磷鉬酸還原法又有無蛋白學濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中加入非離子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多，性能比較穩定的還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐爾等。表面活性劑則以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜聚化合物，方法簡便，便于自動化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有光吸收，必須做標本空白，否則結果偏高。

酶法測定無機磷是發展趨勢，其優點是無機磷酸鹽化合物在酶作用下的中性范圍內是穩定的，可用于常規樣品的自動化分析。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提出一種利用酶循環擴增法(Enzymatic?Recycling?Method)、酶比色法(Enzymatic?ColorimetricMethod)及酶聯法(Couple?Reaction)技術，計量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定無機磷濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的無機磷診斷/測定試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行無機磷濃度的測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。

本發明無機磷濃度測定方法原理如下：

無機磷+谷氨酰胺+腺苷二磷酸?谷氨酰胺合成酶氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸

氨+α-酮戊二酸+還原型輔酶?谷氨酸脫氫酶?谷氨酸+輔酶+水

谷氨酸+水+氧?谷氨酸氧化酶?氨+α-酮戊二酸+過氧化氫

這種方法應用谷氨酰胺合成酶(glutamine?synthetase?EC?6.3.1.2)的酶促作用產生氨。

谷氨酸脫氫酶(glutamate?dehydrogenase?EC?1.4.1.2、EC?1.4.1.3或EC?1.4.1.4)及谷氨酸氧化酶(Glutamate?oxidase?EC?1.4.3.7、EC?1.4.3.11)作為循環酶：谷氨酸脫氫酶的酶促作用產生谷氨酸；谷氨酸氧化酶再將谷氨酸再次變回氨及α-酮戊二酸，使氨不斷地被重復循環利用。

谷氨酸脫氫酶(glutamate?dehydrogenase?EC?1.4.1.2、EC?1.4.1.3或EC?1.4.1.4)作為顯色酶，使還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算出同型半胱氨酸濃度。

實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明無機磷診斷/測定試劑盒較為理想：

緩沖液????????????????????100mmol/L

穩定劑????????????????????50mmol/L

還原型輔酶????????????????0.25mmol/L

谷氨酰胺合成酶????????????6000U/L