[發明專利]腺苷脫氨酶診斷試劑盒及腺苷脫氨酶活性濃度測定方法

無效

• 申請號: 200610097234.8
• 申請日: 2006-10-24
• 公開（公告）號: CN101169375A
• 公開（公告）日: 2008-04-30
• 發明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/25;C12Q1/32;C12Q1/68;C12Q1/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，屬于醫學檢驗測定技術領域。

背景技術

醫學研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機體細胞免疫活性有重要關系的核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別診斷，重癥聯合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鑒別的重要診斷標志。

腺苷脫氨酶的活性測定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據申請人了解，目前國際上普遍采用紫外光法，其測定原理是：腺苷(白色結晶粉末)+水(H₂O)腺苷脫氨酶??肌苷(Inosine)+氨離子(NH₄⁺)，此反映過程生成的肌苷會在波長為265nm處顯現，因此可以通過測定此波長處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無法用一般醫院的可見光分析儀測定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實推廣應用。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提出一種利用酶循環擴增法(Enzymatic?Recycling?Method)、酶比色法(Enzymatic?ColorimetricMethod)及酶聯法(Couple?Reaction)技術，連續監測通過酶聯反應生成吲嗒胺色原(Indamine?dye)或醌亞胺色原(Quioneimine?dye)，所導致在400-700nm波長處吸光度的上升，得以測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行腺苷脫氨酶活性濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。

本發明腺苷脫氨酶活性濃度測定方法原理如下：

腺苷+水????腺苷脫氨酶????肌苷+氨離子

氨離子+丙酮酸+還原型輔酶????丙氨酸脫氫酶????L-丙氨酸???????????????????????????????????????????+水+輔酶

丙氨酸+水+氧????甘氨酸氧化酶????氨離子+丙酮酸+????????????????????????????????????????????????過氧化氫

過氧化氫+還原型色原體組合????過氧化物酶????吲嗒胺色原或?????????????????????????????????????????????????醌亞胺色原+水

腺苷脫氨酶(adenosine?deaminase；EC?3.5.4.4)及丙氨酸脫氫酶(alanine?dehydrogenase；EC?1.4.1.1)作為作用酶，功能為將腺苷經二步酶解產生丙氨酸。甘氨酸氧化酶(glycine?oxidase；EC?1.4.3.19)作為循環酶：甘氨酸氧化酶的酶促作用將丙氨酸再次變回氨離子及丙酮酸，使氨離子及丙酮酸不斷地被重復循環利用，并不斷地循環產生過氧化氫。過氧化物酶(peroxidase；EC?1.11.1.7)作為顯色酶，最終通過和過氧化氫的作用將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm(根據還原型色原體組合的不同而定)波長處，測定染料，吲嗒胺色原(Indamine?dye)或醌亞胺色原(Quioneimine?dye)，含量高低的光吸收大小，通過測量400-700nm(根據還原型色原體組合的不同而定)處吸光度上升的速度，可以測算5’核苷酸酶的活性濃度大小。

實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，如下成分關系的本發明腺苷脫氨酶診斷試劑盒較為理想：

緩沖液????????????100mmol/L

穩定劑????????????50mmol/L

過氧化物酶????????30000U/L

還原型輔酶????????0.25mmol/L

丙氨酸脫氫酶??????8000U/L

甘氨酸氧化酶??????12000U/L

腺苷??????????????8mmol/L

丙酮酸????????????16mmol/L