[發明專利]氨診斷/測定試劑盒及氨濃度的測定方法

無效

• 申請號: 200610097226.3
• 申請日: 2006-10-24
• 公開（公告）號: CN101169410A
• 公開（公告）日: 2008-04-30
• 發明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N21/78;G01N21/25;C12Q1/32;C12Q1/26;C12Q1/00
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技術領域

本發明涉及一種氨診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定氨濃度的方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。

背景技術

氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。

擴散法是標本堿化后，釋放出NH₃，用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應形成棕黃色碘化雙汞胺進行比色。這些方法需要堿化，內源性的氨形成造成影響，使其準確性和精密度受到影響，目前已很少應用；離子交換法比擴散法更準確，CV為8％～13％；離子選擇電極法是利用NH₃擴散到電極表面，引起電極的PH發生變化進行測定，該方法的CV為3.5％～4.8％，回收率高。結合具體實際，應以酶法測定為實用。

檢索中國專利，僅查出87105593.7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發現比較理想的血氨測定方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提出一種利用酶循環擴增法(Enzymatic?Recycling?Method)、酶比色法(Enzymatic?ColorimetricMethod)及酶聯法(Couple?Reaction)技術，計量通過酶聯反應生成吲嗒胺色原(Indamine?dye)或醌亞胺色原(Quioneimine?dye)，所導致在400-700nm波長處吸光度的上升，得以測定氨濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的氨診斷/測定試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行氨濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。

本發明氨濃度測定方法原理如下：

氨離子+丙酮酸+還原型輔酶????丙氨酸脫氫酶????丙氨酸+水??????????????????????????????????????????????????????+輔酶

丙氨酸+水+氧????甘氨酸氧化酶????氨離子+丙酮酸+?????????????????????????????????????????????????過氧化氫

過氧化氫+還原型色原體組合????過氧化物酶????吲嗒胺色原或??????????????????????????????????????????????醌亞胺色原+水

這種方法應用丙氨酸脫氫酶(alanine?dehydrogenase；EC?1.4.1.1)作為作用酶，功能為將氨酶解產生丙氨酸。甘氨酸氧化酶(glycineoxidase；EC?1.4.3.19)作為循環酶：再將丙氨酸再次變回氨，使氨不斷地被重復循環利用，并同時不斷地循環擴增產出過氧化氫。過氧化物酶(peroxidase；EC?1.11.1.7)作為顯色酶，將過氧化氫與還原型色原體組合作用，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm(根據還原型色原體組合的不同而定)波長處，測定染料，吲嗒胺色原(Indamine?dye)或醌亞胺色原(Quioneimine?dye)，含量高低的光吸收大小，通過測量400-700nm(根據還原型色原體組合的不同而定)處吸光度上升的速度，得出氨濃度大小測定結果。

實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，如下成分關系的本發明氨診斷/測定試劑盒較為理想：

緩沖液????????????100mmol/L

穩定劑????????????50mmol/L

還原型輔酶????????0.25mmol/L

丙氨酸脫氫酶??????6000U/L

甘氨酸氧化酶??????8000U/L

丙酮酸????????????16mmol/L

過氧化物酶????????40000U/L

還原型色原體組合??6mmol/L

抗干擾劑??????????30mmol/L

所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任一個組合：

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

石碳酸

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺

3-甲基-2-苯噻唑酮腙

N，N-雙乙基-m-甲苯胺