[發(fā)明專利]銅診斷/測(cè)定試劑盒及銅濃度測(cè)定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200610096885.5
• 申請(qǐng)日: 2006-10-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101169424A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王爾中
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/84
• 分類號(hào): G01N33/84;G01N21/78;G01N21/25;C12Q1/26;C12Q1/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種銅診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定銅濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

正常成人體內(nèi)含銅量為80～150mg，血循環(huán)銅占總銅量的10％。血漿中約95％銅a₂球蛋白牢固結(jié)合，稱為銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin)，經(jīng)酸處理后才能與銅試劑反應(yīng)。其余5％為游離銅。許多酶都含有銅，如細(xì)胞色素氧化酶、超氧化物岐化酶、尿酸氧化酶、賴氨酸氧化酶、酪氨酸酶、多巴胺β-羥化酶等。與白蛋白疏松結(jié)合的銅是運(yùn)輸、吸收、排泄的重要形式和中間環(huán)節(jié)，也是合成各種細(xì)胞蛋白的原料。其它銅蛋白還有血銅蛋白、肝蛋白和腦銅蛋白。銅參與造血過(guò)程，主要影響鐵的吸收、運(yùn)送和利用。

生物體液與組織中銅的測(cè)定方法包括分光光度法，火焰和無(wú)火焰原子吸收分光光度法、發(fā)射光譜法、中子活化分析法和陽(yáng)極溶出伏安法等。銅的分光光度法都是利用銅形成有色絡(luò)合物。火焰原子吸收法利用銅離子在火焰中被還原為Cu⁰，從銅空心陰極燈發(fā)出的光波Cu⁰吸收的量與濃度成正比，用于血清、尿、組織中銅的測(cè)定。陽(yáng)極溶出伏安法是將銅離子作為汞齊被鍍于陽(yáng)極上，電壓變得更正，使Cu從陽(yáng)極“剝下”或再次溶解，形成的電流與Cu的濃度成正比，廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析。中子活化分析是利用中子將⁶³Cu轉(zhuǎn)變成不穩(wěn)定⁶⁴Cu同位素，后者衰變時(shí)釋放γ射線可在1。34MeV計(jì)數(shù)，應(yīng)用于特定研究中心。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提出一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法(Enzymatic?Recycling?Method)、酶比色法(Enzymatic?ColorimetricMethod)及酶(偶)聯(lián)法(Couple?Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定銅濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的銅診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行銅濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。

本發(fā)明銅濃度測(cè)定方法原理如下：

這種方法應(yīng)用需要銅激活的賴氨酸氧化酶(lysine?oxidase；EC1.4.3.13；EC?1.4.3.14)酶(偶)聯(lián)丙氨酸脫氫酶(alanine?dehydrogenase；EC?1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine?oxidase；EC?1.4.3.19)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。賴氨酸氧化酶作為作用酶，功能為將賴氨酸酶解產(chǎn)生氨。丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶作為循環(huán)酶：丙氨酸脫氫酶的酶促作用使氨產(chǎn)生丙氨酸；甘氨酸氧化酶再將丙氨酸再次變回氨，使氨不斷地被重復(fù)循環(huán)利用。丙氨酸脫氫酶同時(shí)又作為顯色酶，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算銅的濃度大小。

實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明銅診斷/測(cè)定試劑盒較為理想：

緩沖液???????????????????100mmol/L

穩(wěn)定劑???????????????????50mmol/L

還原型輔酶???????????????0.25mmol/L

賴氨酸???????????????????20mmol/L

丙酮酸???????????????????16mmol/L

賴氨酸氧化酶?????????????12000U/L

丙氨酸脫氫酶?????????????16000U/L

甘氨酸氧化酶?????????????16000U/L

本發(fā)明的銅診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括：

緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、賴氨酸、丙酮酸、賴氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。

試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。

也可以將上述單劑試劑配成如雙劑試劑：

試劑1

緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、賴氨酸、丙酮酸。

試劑2

緩沖液、穩(wěn)定劑、賴氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。