[發明專利]瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠及制備方法

無效

• 申請號: 200610091432.3
• 申請日: 2006-06-08
• 公開（公告）號: CN101086498A
• 公開（公告）日: 2007-12-12
• 發明（設計）人: 喻梅輝;張紅;馬光玉;王葉筠;周志成;丁建軍;穆全昌;姜明;張興平
• 申請（專利權）人: 新疆西域實業集團有限責任公司
• 主分類號: G01N33/547
• 分類號: G01N33/547;G01N33/546;G01N33/531;G01N33/569
• 代理公司: 烏魯木齊市禾工專利代理事務所
• 代理人: 劉永生

一、技術領域

本發明屬于一種用于檢測由燕麥嗜酸菌西瓜亞種病菌引起的瓜類細菌性果實腐斑病，即BFB的特異試劑及其制備方法，尤其是一種瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠及制備方法。

二、背景技術

燕麥嗜酸菌西瓜亞種(Acidovorax?avenae?subsp.citrulli)，簡稱Aac，可以引起瓜類細菌性果實腐斑病(Bacterial?fruit?blotch?of?cucurbits)，簡稱BFB，這種細菌屬于世界性檢疫有害生物，而尤其引起的上述病害是我國公布的《中華人民共和國進境植物檢疫危險性病、蟲、雜草名錄》中規定的三類危險性病害。

瓜類細菌性果實腐斑病目前發病地區有日益擴大的趨勢。該病苗期癥狀常表現為大的黑色病斑而無任何水浸狀，這使田間診斷變的很困難，病原細菌的分離培養診斷需要10～14d，程序繁瑣。瓜類種子細菌性果實腐斑病帶菌率大于0.1％時，就可能給生產帶來較大損失。但如此低的帶菌率，給檢測增加了很大的難度，如用99％的準確度確保種子批號的帶菌率在0.1％以下，每個批號需抽取50000粒種子檢測，這就是檢測費用高的原因之一。研制出適合我國實際的種子帶菌檢測技術，是防止該病在我國蔓延的有效措施之一。

目前檢測瓜類種子細菌性果實腐斑病的方法有：

(1)幼苗檢測。即在溫室條件下，創造適合瓜類細菌性果實腐斑病的發病條件，即溫度在27～30℃之間，濕度在85％以上，一般需要4～5周后才可檢測出種子細菌性果實腐斑病的帶菌率。這種方法是傳統的病菌檢測方法，是國際種子協會認可的檢測方法，能反映在實際情況下可能的發病情況，但條件較難控制，費時，占地大，費用高。根據我國制種批次小，分散的具體實情，這種檢測方法很難推廣應用。

(2)保濕生長盒檢測法。即在透光的塑料盒中裝入蛭石和珍珠巖，然后將種子散播其上，密封后放入25℃，日光燈人工生長室中，大約兩周后即可檢測出病苗。這種方法的優點是條件控制準確，占地小，易于規范化操作，準確性較高；缺點是有時會受苗期其它病害如瘁倒病的干擾。

(3)利用半選擇性培養基。將種子發芽后保濕保溫，然后將幼苗勻漿液在半選擇培養基上進行選擇培養，找出細菌性果實腐斑病菌菌落，將其純化后再根據病菌的生理生化和病理特征確認。也可從種子中分離獲得，可先將種皮和種胚分離后分別置于pH7.1的磷酸緩沖液中培養過夜，然后劃線分離，以確定種子是內部帶菌還是外部帶菌。對病葉、病果，取新鮮病健交界處病斑，用KB培養基就能夠分離得到。瓜類細菌性果實腐斑病菌在該培養基上37℃培養2d可見菌落，3d后，菌落圓形，直徑1～2mm，3～4d后，菌落繼續擴大，形成一個橄欖綠中心的環形，而多數其它種傳細菌菌落藍色菌落更小。

(4)血清學檢測方法。近年趨向于利用熒光抗體法和酶聯吸附法。熒光抗體法(fluorescent?antibody?technique)是將熒光染料與抗體以化學方法結合起來形成標記抗體。抗體與熒光染料結合不影響抗體的特性，標記的熒光抗體與相應的抗原結合后，受熒光顯微鏡高壓汞燈光源的紫外光照射，便激發出熒光，熒光的存在就表示抗原的存在。酶聯免疫吸附法，enzyme?linked?immunosorbent?assay簡稱ELISA，是繼免疫熒光技術和放射免疫技術之后發展起來的一種免疫標記技術。有直接法、間接法、雙抗夾心法及競爭法。ELISA具有選擇性好、靈敏度高、結果判斷客觀準確、實用性強的優點而廣泛應用于生物和醫學領域。ELISA技術對大量樣品的檢測尤其適合。血清學技術最主要的缺點是受抗血清質量和專化性的限制。多克隆抗體制備簡單，但通常和近緣細菌有交叉反應，飽和吸附雖然可以消除部分交叉反應，但常以降低效價為代價；單克隆抗體雖然專化性好，但一般只能檢測一個或幾個血清型的細菌，制備過程復雜，技術和設備要求較高。