[發明專利]埃博霉素B的制備方法和用途

有效

• 申請號: 200610091035.6
• 申請日: 2006-07-12
• 公開（公告）號: CN101104864A
• 公開（公告）日: 2008-01-16
• 發明（設計）人: 張慶林;王赫;肖鳳君;王石齊;李學林;易志恒
• 申請（專利權）人: 湖南迪諾制藥有限公司;中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于制藥技術領域，具體的說，涉及埃博霉素B的制備方法、制劑工藝及其制備治療格列衛耐藥的慢性髓細胞性白血病藥物的用途。

背景技術

埃博霉素為上個世紀八十年代末GBF的微生物學家發現的粘細菌纖維堆囊菌SorangiumCellulosum產生的次級代謝產物。1987年分離出兩種新的大環內酯物命名為埃博霉素A和B，實驗發現對培養的真菌病原體有抑制活性。1994年美國國家癌癥學會發現埃博霉素B對腫瘤細胞具有抑制活性，Merck實驗室發現它和紫杉醇至少在微管蛋白聚合實驗中有相同作用，證明了埃博霉素對腫瘤細胞有抑制作用的事實。

進一步研究發現，埃博霉素具有比紫杉醇優越的抗腫瘤特性。①埃博霉素比紫杉醇水溶性好，結構簡單，有利于化學合成埃博霉素及結構衍生化。②埃博霉素沒有紫杉醇細胞內毒素活性。③與紫杉醇不同，埃博霉素在P糖蛋白表達型的多藥耐藥性細胞中也維持很大的細胞毒性。④在Richard等研究的紫杉醇敏感的人類細胞系中，埃博霉素B比埃博霉素A和紫杉醇具有更大的抗增殖活性，而埃博霉素A往往比紫杉醇的活性更低。另外，埃博霉素對一株多藥耐藥性直腸癌系和紫杉醇抗性卵巢癌系仍然具有敏感性。目前埃博霉素有幾種同類物質已經進入臨床研究階段。主要包括Epothilone?B(EPO?B)，Epothilone?D及BMS-247550。在對300個病人的初步臨床實驗中，該化合物對結腸癌、乳腺癌、腎臟和卵巢癌，有確切的療效。

R₁＝Me??R₂＝H????epothilone?A

R₁＝Me??R₂＝Me???epothilone?B

目前公開發表的通過發酵制備埃博霉素B方法生產成本高，尚需研究大規模和簡單廉價的發酵制備技術和分離純化方法。

慢性髓細胞性白血病(Chronic?myeloid?leukemia，CML)是血液系統最常見的惡性疾病之一，在國內年發病率約為0.36/10萬，占白血病的第三位。CML的分子生物學特征是存在bcr/abl融合基因，該基因通過轉錄翻譯產生分子量為210KDa的融合蛋白P₂₁₀^bcr/abl，該融合蛋白具有異常增高的酪氨酸激酶活性，使造血干細胞發生異常轉化而導致CML發生。K562細胞系來源于急變期CML病人，P₂₁₀^bcr/abl呈陽性，是研究CML經典的細胞模型。

目前治療CML的前線化學藥物是2001年新上市的格列衛(Glivec，或稱STI571)^[1]。屬于α-苯胺嘧啶衍生物，格列衛作用的機理是作用ATP與酪氨酸激酶結合位點，特異性抑制ABL酪氨酸激酶。雖然應用格列衛能夠使急變期CML完全緩解，但大部分病人對格列衛的應答期較短，最終細胞對其耐藥而使臨床復發(2)。CML細胞對格列衛的耐藥機理比較復雜。由于格列衛上市不久的新藥，目前還沒有很好的方法克服CML對其耐藥性。目前人們對CML治療研究是嘗試延緩或阻止CML細胞對格列衛產生耐藥性，其中通過篩選發現與格列衛不同結構、不同作用機制的活性化合物，克服細胞對格列衛的耐藥性，或與格列衛合并使用克服細胞的耐藥性，成為CML治療研究的一個重要方向。

發明內容

本發明提供了一種大規模發酵生產埃博霉素B的方法。

具體的說，本發明方法包括如下步驟：

(a).種子液在發酵罐發酵培養12～96小時，加入1％～10％吸附劑，吸附代謝產物

(b).發酵100-150小時后停止發酵，稠布過濾發酵液收獲吸附劑

(c).吸附劑用異丙醇提取后減壓濃縮或用水浸潤，再用乙酸乙脂萃取旋轉蒸發至干，得含埃博霉素B粗提物

(d).提取物使用低級醇溶解后，先經過常壓柱層析用低級醇與氯代烷的混合液或單用低級醇洗脫

(e).HPLC檢測并合并含埃博霉素B的餾份，減壓濃縮到一定體積后，通過液相色譜進一步純化，得到純化的埃博霉素B。

步驟a中的種子液可由凍存菌種逐級放大培養后再轉入培養基中培養1～5天得到，菌種可為商業菌種如纖維堆囊菌ATCC?15384號經紫外或誘變劑誘變菌種，或為土壤中分離得到的其他纖維堆囊菌種。

吸附劑優選弱極性大孔吸附樹脂，如AB-8、DA201等。