[發(fā)明專利]一種在體外大規(guī)模擴增子宮內(nèi)膜細(xì)胞的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200610086685.1
• 申請日: 2006-06-28
• 公開（公告）號: CN101096653A
• 公開（公告）日: 2008-01-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王常勇;王海濱;江紅;郭希民;段翠密;王和平;宋宇軒
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬組織工程領(lǐng)域，涉及一種在體外大規(guī)模擴增子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的生物技術(shù)方法。這種方法能有效地分離、純化及擴增子宮內(nèi)膜細(xì)胞。

背景技術(shù)

組織工程是應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原理與技術(shù)，在正確認(rèn)識哺乳動物的正常及病理兩種狀態(tài)下結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)生物替代物的科學(xué)。子宮作為雌性哺乳動物的重要生殖器官，在孕育胎兒和各種病理與生殖機制研究中占有重要地位。子宮的生理功能主要由子宮內(nèi)膜執(zhí)行，子宮內(nèi)膜細(xì)胞包括有分泌功能的腺上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞，子宮內(nèi)膜是胚胎發(fā)育的“溫床”，同時也是許多子宮疾病易發(fā)的部位。體外構(gòu)建出子宮組織具有重要的理論和現(xiàn)實意義，除子宮組織修復(fù)外，還可作為子宮肌瘤和內(nèi)膜異位癥等病理機制的體外研究和胚胎植入機制研究提供理想的體外研究模型。鑒于子宮在生殖生理研究中的重要性，2001年美國華裔科學(xué)家劉宏清教授在體外構(gòu)建子宮內(nèi)膜并在其上進(jìn)行人胚胎的培養(yǎng)引起了世界的關(guān)注^[1]。但是因為倫理問題沒有報道具體的實施方案，工作也未能進(jìn)行下去。2003年P(guān)ark進(jìn)行了體外子宮內(nèi)膜腫瘤侵襲模型的研究，為體外進(jìn)行相關(guān)疾病研究提供了一個借鑒^[2]。

組織工程化組織主要取決于以下三個關(guān)鍵性制約因素：種子細(xì)胞、支架材料以及有助于細(xì)胞生長、組織再生的外在環(huán)境。其中獲得足夠數(shù)量且具有再生活力的種子細(xì)胞是開展子宮組織工程研究的前提和基礎(chǔ)。

組織工程化子宮組織構(gòu)建首先要獲得高純度的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞。子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外分離有多種方法，Ostee^[3]與陳秀荔^[4]等用濾網(wǎng)法得到較高純度的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。Bongo^[5]等和Dong^[6]用離心法分離了人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。Fernandez等^[7]將懸浮的子宮內(nèi)膜細(xì)胞吸附在用Thy-1抗體包被的免疫磁珠上，用免疫磁珠法也成功分離了子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，分離的上皮細(xì)胞純度82％，存活率76％。過濾法分離的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞純度雖高，但該方法步驟繁瑣，易污染，細(xì)胞損失大，對細(xì)胞活力也有影響。而免疫磁珠法則存在成本高等問題。

子宮內(nèi)膜主要由腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞組成，它們具有自分泌/旁分泌功能，且受多種因素調(diào)節(jié)?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞能分泌激素，細(xì)胞因子如表皮生長因子(EGF)、白介素(IL)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等，酶類如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、內(nèi)啡肽酶等以及多種功能蛋白如胎盤糖蛋白、整合蛋白等，這些物質(zhì)對于子宮本身的生理功能和病理狀態(tài)、胚胎著床、發(fā)育及生理平衡起著重要的作用。其中激素的調(diào)節(jié)是最為重要的方式。有研究表明，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在正常生理條件下受體內(nèi)激素尤其是雌激素(E2)和孕激素(P4)的影響呈周期性變化。Emilia?Pierro(2001)的研究表明雌激素的促人子宮上皮細(xì)胞(EEC)增殖作用可能至少部分是由于間質(zhì)細(xì)胞(ESC)分泌的IGF?I介導(dǎo)所致^[8]。

在子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)與擴增方面，目前一般采用的原代培養(yǎng)。上皮細(xì)胞一般不能夠傳代，所用的培養(yǎng)環(huán)境通常為含有一定比例(如10％等)血清的培養(yǎng)基(如DMEM/F12)進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，也有研究發(fā)現(xiàn)胰島素對子宮內(nèi)膜細(xì)胞有較強的促增殖作用。

發(fā)明內(nèi)容

為了有效的提高子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外純化率以及增殖能力，本發(fā)明的目的是提供一種子宮內(nèi)膜細(xì)胞分離純化及擴增培養(yǎng)的方法。

本發(fā)明第一個目的即子宮內(nèi)膜細(xì)胞分離純化通過以下方案實現(xiàn)：

首先對實驗動物進(jìn)行促情激素(PMSG)和促排卵激素(hCG)處理從而調(diào)節(jié)其子宮生理至內(nèi)膜“增殖期”，然后用外科手術(shù)法分離其兩側(cè)子宮并刮取子宮內(nèi)膜，胰蛋白酶或I型膠原酶消化分離后，利用離心法純化子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞。

本發(fā)明的第二個目的是在隨后的純化細(xì)胞擴增培養(yǎng)中，建立一種體外培養(yǎng)體系，所用的體外培養(yǎng)體系含有雌激素與孕激素，其組成為DMEM/F12、胎牛血清、雌二醇(E2)、孕激素(P4)，其組成比例為DMEM/F12、10％胎牛血清、10nmol/L-100nmol/LE2、10nmol/L-100nmol/LP4。

本發(fā)明的有益效果是：