[發(fā)明專利]5’-核苷酸酶診斷試劑盒及5’-核苷酸酶活性濃度的測定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200610085588.0
• 申請日: 2006-06-26
• 公開（公告）號: CN101097201A
• 公開（公告）日: 2008-01-02
• 發(fā)明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/78;G01N33/50;G01N33/52;C12Q1/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種5’-核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定5’-核苷酸酶活性濃度的測定方法，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

醫(yī)學研究表明，5’-核苷酸酶(5NT)增高主要見于阻塞性黃膽，也可見于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁性肝硬化和慢性肝炎時，5NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時5NT升高的敏感性高于堿性磷酸酶。因為5’-核苷酸酶活性無生理性升高，對于診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測定5’-核苷酸酶的活性對于疾病的診斷具有重要意義。

5’-核苷酸酶的活性測定方法很多，主要有同位素底物法、化學強酸測磷法(1925年)。據(jù)申請人了解，目前國際上普遍采用同位素底物測試法，方法為：5’-核苷酸酶作用于H³-dUMP，終止反應后，通過離子交換層析柱分析結(jié)果，求得5’-核苷酸酶活性。或者利用5’-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產(chǎn)生無機磷，再用化學強酸法分析無機磷含量得以計算出5’-核苷酸酶的活性。

同位素底物法方法復雜還有同位素污染，而且需要同位素測定儀，因此難以切實推廣應用。無機磷測定法是1925年發(fā)明的方法，準確度不好，強酸污染環(huán)境等等，也不適合推廣應用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提出一種利用酶循環(huán)擴增法(Enzymatic?Recycling?Method)、酶比色法(Enzymatic?ColorimetricMethod)及酶聯(lián)法(Couple?Reaction)技術(shù)，計量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定5’-核苷酸酶活性濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的5’-核苷酸酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行5’-核苷酸酶活性濃度的測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。

本發(fā)明5’-核苷酸酶活性濃度測定方法原理如下：

腺苷單磷酸+水?5’-核苷酸酶?腺苷+單磷酸鹽

腺苷+水?腺苷脫氨酶?肌苷+氨離子

氨離子+α-酮戊二酸+還原型輔酶?谷氨酸脫氫酶?谷氨酸

???????????????????????????????????+輔酶+水

谷氨酸+水+氧?谷氨酸氧化酶?氨離子+α-酮戊二酸+

???????????????????????????????過氧化氫

這種方法應用腺苷脫氨酶(Adenosine?Deiminase?EC?3.5.4.4)將腺苷酶解產(chǎn)生氨。

谷氨酸脫氫酶(glutamate?dehydrogenase?EC?1.4.1.2、EC?1.4.1.3或EC?1.4.1.4)及谷氨酸氧化酶(Glutamate?oxidase?EC?1.4.3.7、EC1.4.3.11)作為循環(huán)酶：谷氨酸脫氫酶的酶促作用產(chǎn)生谷氨酸；谷氨酸氧化酶再將谷氨酸再次變回氨及α-酮戊二酸，使氨不斷地被重復循環(huán)利用。

谷氨酸脫氫酶(glutamate?dehydrogenase?EC?1.4.1.2、EC?1.4.1.3或EC?1.4.1.4)作為顯色酶，使還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算出5’-核苷酸酶活性濃度。

實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明5’-核苷酸酶診斷試劑盒較為理想：

緩沖液??????????100mmol/L

穩(wěn)定劑??????????50mmol/L

還原型輔酶??????0.25mmol/L

腺苷脫氨酶??????2000U/L

谷氨酸脫氫酶????50000U/L

谷氨酸氧化酶????10000U/L

α-酮戊二酸?????16mmol/L

本發(fā)明的5’-核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括：