[發明專利]重組氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型的建立及應用

無效

• 申請號: 200610081505.0
• 申請日: 2006-05-24
• 公開（公告）號: CN101078007A
• 公開（公告）日: 2007-11-28
• 發明（設計）人: 游雪甫;李聰然;蔣建東;楊信怡;洪斌;王躍明;肖春玲;孫承航
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫藥生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/54;C12N9/10;C12Q1/48
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1、一種重組大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)CGMCC1667，其特征在于它含有重組質粒pET-30a-aac(6′)-aph(2″)，該質粒上插有氨基糖苷類雙功能修飾酶基因aac(6′)-aph(2″)。

2、一種根據權利要求1所述的重組大腸埃希氏菌誘導表達得到的氨基糖苷類雙功能修飾酶。

3、一種重組氨基糖苷類雙功能修飾酶體外代謝模型，它包括以下步驟：

(1)用權利要求1所述的重組大腸埃希氏菌誘導表達氨基糖苷類雙功能修飾酶，制備酶提取物；

(2)酶提取物和氨基糖苷類抗生素在孵育體系中進行磷酸化或乙酰化反應；

(3)取步驟(2)中得到的反應混合物用衍生化試劑進行衍生化，離心，取上清進行高效液相色譜檢測，計算氨基糖苷類抗生素的被修飾百分率，評價其對雙功能修飾酶的穩定性。

4、根據權利要求3所述的模型，其特征在于所述的氨基糖苷類抗生素包括天然的和半合成的氨基糖苷類抗生素。

5、根據權利要求3所述的模型，其特征在于在步驟(2)中的孵育體系為：磷酸化反應測試組：每100μL體系中含1～100μmol?Tris.Cl，0.1～10.0μmolMgCl₂，0.1～10.0μmol?Na₂HPO₄，0.1～10.0μmol?ATP，5～500nmol氨基糖苷類抗生素，1～20μL酶提取物；磷酸化反應對照組：每100μL體系中含1～100μmolTris.Cl，0.1～10.0μmol?MgCl₂，0.1～10.0μmol?Na₂HPO₄，5～500nmol氨基糖苷類抗生素，1～20μL酶提取物；乙酰化反應測試組：每100μL體系中含1～100μmol?Tris.Cl，0.1～10.0μmol?MgCl₂，10～500nmol?acetyl?CoA，5～500nmol氨基糖苷類抗生素，1～20μL酶提取物；乙酰化反應對照組：每100μL體系中含1～100μmol?Tris.Cl，0.1～10.0μmol?MgCl₂，5～500nmol氨基糖苷類抗生素，1～20μL酶提取物；孵育溫度為30～40℃，孵育時間為0.5～24小時。

6、根據權利要求3所述的模型，其特征在于所述的衍生化試劑選自鄰苯二甲醛、丹磺酰氯、1-氟-2，4-二硝基苯、9-芴基甲基氯甲酸酯、異硫氰酸苯酯中的一種或多種。

7、根據權利要求6所述的模型，其特征在于所述的衍生化試劑為鄰苯二甲醛衍生化試劑。

8、根據權利要求3所述的模型，其特征在于步驟(3)中高效液相色譜檢測條件為：色譜柱為C8或C18反相色譜柱；流動相為甲醇∶水∶冰醋酸＝50～75∶20～45∶5(體積/體積)，其中加入庚烷磺酸鈉1～5g/L，或為甲醇：10～500mM醋酸鹽＝80～20∶20～80(體積/體積)；流速為0.5～2.0mL/min；柱溫為30～50℃；檢測波長為300～400nm。

9、根據權利要求3所述的模型在篩選氨基糖苷類雙功能修飾酶穩定性抗生素和氨基糖苷類雙功能修飾酶抑制劑中的應用。