[發明專利]一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖制備方法及其聯合疫苗

有效

• 申請號: 200610081288.5
• 申請日: 2006-05-29
• 公開（公告）號: CN101081296A
• 公開（公告）日: 2007-12-05
• 發明（設計）人: 鄭海發;李貴凡;阮承邁
• 申請（專利權）人: 北京民海生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/02
• 分類號: A61K39/02;A61K39/116;A61P29/00;A61P31/00;A61P19/02;A61P11/00;C08B37/00
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技術領域

本發明涉及一種b型流感嗜血桿菌(Hib)莢膜多糖制備方法。具體而言，本發明涉及一種b型流感嗜血桿菌(Hib)莢膜多糖的純化以及后續的結合疫苗制備，本發明還涉及該結合疫苗和其他抗原組分形成聯合疫苗的制備方法。

背景技術

b型流感嗜血桿菌(Hib)多糖結合疫苗適用于2月齡～5歲的嬰幼兒，預防Hib所引起的腦膜炎、肺炎、敗血癥、蜂窩組織炎、關節炎、會厭炎等感染性疾病。據估計，Hib所致疾病在全世界范圍內每年至少發生300萬例和導致數十萬人死亡。因此，世界衛生組織(WHO)推薦將Hib疫苗列入擴大免疫規劃中，美國也將Hib疫苗列入推薦的兒童免疫程序中。

早在1933年，Fothergill和Wright即證實了Hib腦膜炎的發生率與年齡及體內的抗莢膜多糖抗體水平成反比。新生兒是通過胎盤傳遞獲得血清殺菌抗體，從母體獲得的抗體主要存在于小于6月齡的兒童，而2～5歲的小兒可產生天然抗體，因而6月齡～2歲是Hib感染的高峰。同時，Hib抗體具有型特異性的特點和保護作用。目前，世界上已有80多個國家應用Hib疫苗，很多國家已將其納入兒童計劃免疫之中。成功地用于預防，可使Hib疾病大大減少，乃至消失。自從1987年以來，美國將Hib結合疫苗廣泛應用，Hib導致的5歲以下兒童疾病的發生率大大下降。從1987年以前的100/10萬下降到近年來的1/10萬。1998～2000年，每年僅有大約66例Hib病例。

在亞洲，Hib疾病及Hib疫苗的研制問題正在研究之中，目前我國尚未將Hib疫苗列入兒童計劃免疫。從王亞娟等人的研究結果看，至少1/4的病例是由肺炎鏈球菌或Hib引起，兒童Hib的感染率較高，明顯高于芬蘭、美國、英國等。所以大規模針對這兩種病原的疫苗對兒童應用可能對人口眾多的中國是有益的。(王亞娟等，中國計劃免疫2004年6月第10卷第3期第176頁)

在Hib疫苗制備過程中，莢膜多糖的制備是關鍵的步驟。純化莢膜多糖，目前多采用沉淀法和凝膠層析法，或兩者相結合的方法。凝膠層析法影響因素少，純化環境溫和，因而多糖破壞少，但費時費力，每次分離量少；而且，在相對分子質量估計不清楚時，凝膠的選擇有一定困難。沉淀法多采用乙醇、丙酮及長鏈季銨鹽類作沉淀劑，該方法無凝膠層析法的缺點，但純化環境不夠溫和，影響因素亦較多。50年代，Scott首先發現十六烷基三甲基溴化銨(Cetavlon)對酸性多糖有較強的沉淀作用，能與多糖形成季胺絡合物而沉淀多糖。目前，Cetavlon已廣泛用于各種細菌莢膜多糖的純化制備，但含有磷壁質酸的革蘭陽性細菌或被磷壁質酸污染的莢膜多糖，不易被Cetavlon所沉淀。Cetavlon對酸性多糖沉淀作用較強，但對中性多糖、核酸和蛋白質等物質亦有不同程度的沉淀作用。因此，要獲得成分均一、純度較高的莢膜多糖，必須進一步去除可能一起沉淀的核酸或蛋白質類。

多糖的常規提取方法：在我國是采用和流行性腦炎雙球菌和傷寒Vi莢膜多糖提取相似的工藝，簡述如下：1)去核酸：將己殺菌的培養液(單批或多批混合)離心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物用注射用水溶解，并加入適量1mol/L氯化鈉(或2mol/L氯化鈣)溶液，搖動或攪拌1小時，使多糖與十六烷基三甲溴化銨解離；加入乙醇至最終濃度為25％，2-8℃靜置1-3小時或過夜，離心收集澄清的上清液。2)沉淀多糖：于上述上清液中加人冷卻乙醇至最終濃度為80％，充分振搖使多糖沉淀，離心收集沉淀；沉淀物用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后即為多糖粗制品。3)多糖純化：將多糖粗制品溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達5-20mg/ml；按1:2容量用冷酚(100g結晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取數次，離心收集上清液，并用0.1moI/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析(必要時或有條件時也可用其他方法去除內毒素)；加入乙醇至最終濃度為75％一80％，離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用滅菌注射用水溶解，即為精制多糖原液。該流程的缺點是難以將提取物中的核酸含量控制在低于1％以下。(楊耀等，中國生物制品學雜志2002年第15卷第3期，第171頁)難以獲得符合規范的Hib多糖提取物，所以在該步驟予以改進以獲得較高純度的產物是有實際意義的。