[發明專利]蘿芙木1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構酶蛋白編碼序列

無效

• 申請號: 200610054597.3
• 申請日: 2006-11-14
• 公開（公告）號: CN101182528A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發明（設計）人: 廖志華;陳敏;諶容
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/61
• 分類號: C12N15/61;C12N9/90;C12N15/79
• 代理公司: 重慶華科專利事務所
• 代理人: 康海燕

技術領域

本發明涉及的是一種蛋白編碼序列，特別是一種蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶蛋白編碼序列，屬于基因工程領域。

背景技術

高血壓是嚴重危害人類健康的疾病，我國已成為世界上高血壓危害最嚴重的國家。據中國疾病預防控制中心健康教育所公布的最新居民營養與健康狀況調查結果顯示：中國內地高血壓患病人數已達一億六千萬，因而對降壓藥物，尤其是天然降壓藥物的需求十分巨大。蘿芙木(Rauvolfia?verticillata)是夾竹桃科蘿芙木屬的一種重要的藥用植物，為中國特有。它的根中含有利血平(reserpine)、阿嗎堿(ajmalicine)和利血胺(rescinnamine)等多種藥用萜類吲哚生物堿，其中利血平是目前應用最廣泛的抗高血壓藥物之一。由于天然蘿芙木資源有限，其藥用部位根中藥用生物堿含量很低，使得蘿芙木野生資源遭到嚴重破壞，因而，尋找新的藥源十分必要。植物次生代謝途徑，分子生物學的飛速發展和植物生物技術的日趨成熟，使得利用基因工程獲得蘿芙木中天然降壓藥物利血平成為可能。

植物中的甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(MEP)途徑在1994年首次發現，該途徑定位于質體中，獨立于經典的甲瓦龍酸(MVA)途徑。在模式植物擬南芥的研究中，發現在1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶(1-Deoxy-D-xylulose?5-phosphate?reductoisomerase，DXR)作用下，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(1-Deoxy-D-xylulose?5-phosphate，DXP)經原子重排和還原生成MEP，該反應是MEP途徑上最重要的限速步驟，也是萜類物質代謝工程最重要的靶點。在產抗癌萜類吲哚生物堿植物長春花中，DXR的表達量與單萜吲哚生物堿的積累表現為正相關，是萜類吲哚生物堿生物合成重要的調節基因。作為MEP途徑最重要的限速酶，DXR是MEP途徑代謝工程最理想的靶點。Croteau等人把來源于薄荷的DXR和MS??(薄荷呋喃合成酶)共轉化薄荷，使得薄荷精油的含量提高了50％，該研究于2001年發表在美國科學院院報，表明用代謝工程技術突破DXP途徑中上下游限速瓶頸，可以實現對目標產物的高量表達。可以推斷，要提高蘿芙木中利血平的含量，DXR將會是一個很有效的代謝工程靶點，然而遺憾的是，到目前為止，還未見從蘿芙木或與其同屬的其他物種中克隆DXR基因的報道。根據GeneBank中1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶的核苷酸序列，結合RACE技術我們從蘿芙木中克隆了相關序列，根據GeneBank的搜索結果，將該基因命名為1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶基因。

在對現有文獻的分析中，未見蘿芙木萜類吲哚生物堿生物合成途徑上的DXR基因的克隆，至今尚未發現與本發明主題有密切聯系文獻的報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶蛋白編碼序列。本發明公開了蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶的氨基酸序列以及蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶基因的核苷酸序列，為最終打破TIAs途徑上的限速反應步驟，為利血平的代謝工程提供候選基因和作用靶點，及其在利用轉基因技術提高利血平等萜類吲哚生物堿的含量的應用。

本發明是通過以下技術方案實現的：在本發明所分離出的DNA分子，該分子包括：編碼具有蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ?ID?NO.3中從核苷酸第172-1596位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-55℃條件下與SEQ?ID?NO.1中從核苷酸第172-1596位的核苷酸序列雜交。

本發明所分離出的蘿芙木1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶蛋白編碼序列多肽，它包括：具有SEQ?ID?NO.1氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ?ID?NO.1序列的多肽。

本發明DNA分子包含所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。

本發明DNA分子轉化的宿主細胞是真核細胞。在實例中該宿主細胞是蘿芙木。

在本發明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。