[發明專利]靶向EBV－LMP1的脫氧核酶在制備治療EBV相關實體瘤藥物中的應用

有效

• 申請號: 200610032257.0
• 申請日: 2006-09-18
• 公開（公告）號: CN101147801A
• 公開（公告）日: 2008-03-26
• 發明（設計）人: 曹亞;盧忠心;孫侖泉
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: A61K38/43
• 分類號: A61K38/43;A61P35/00
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司
• 代理人: 盧宏

技術領域

本發明涉及一種脫氧核酶的醫藥用途，具體地是一種靶向EBV-LMP1的脫氧核酶的醫藥用途。

背景技術

EB(Epstein-Barr)病毒是一種與多種腫瘤發生發展密切相關的外部致病因子，它除了與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤、HIV感染或其他免疫抑制疾病有關的B淋巴細胞瘤、T細胞淋巴瘤、Hodgkin病的發病有關外，最近的研究發現EB病毒還與肺癌、胃癌、乳腺癌、膽管癌、平滑肌瘤、結腸癌、前列腺癌等多種腫瘤的發生有關^[1-3]。其中鼻咽癌是一種具有種族和地理分布差異的上皮細胞性惡性腫瘤，在中國南方人群中發病率比白種人高100倍以上^[4，5]。鼻咽癌的發生發展與EBV(EB病毒)感染密切相關^[6，7]，EBV編碼的癌蛋白LMP1(Latent?Membrane?Protein)在鼻咽癌的發生發展過程中具有重要作用，并且在鼻咽癌病人中，LMP1陽性率高達75％以上^[8]。

在EBV相關腫瘤中EBV基因組的持續存在為腫瘤治療提供了一個新的以病毒為靶的基因治療策略。

LMP1是EBV編碼的目前已被確證的具有瘤基因功能的與原代B細胞、鼠成纖維細胞和人上皮細胞等轉化有關的致瘤蛋白，在EBV相關腫瘤的發病中起著重要作用。本發明的發明人對LMP1在細胞信號轉導通路中的作用進行了大量研究，已經證實LMP1主要介導NF-κB、AP-1和STAT三條信號轉導通路及這些信號轉導通路之間的信息交流(cross-talk)，導致細胞周期紊亂、凋亡阻滯和細胞增殖失控^[9-12]。目前，以LMP1為靶點的實驗研究正在興起。在EBV陽性的鼻咽癌細胞系C666中，應用RNAi技術抑制LMP1的表達能夠顯著抑制細胞的侵襲潛能^[13]。在EBV陽性的鼻咽癌細胞系C611中，應用RNAi技術抑制LMP1的表達能夠顯著抑制細胞的增殖生長^[14]。應用反義核酸技術抑制LMP1的表達能夠抑制EBV感染的B細胞的增殖，并且能夠調節一些表面分子的表達^[15，16]。我們的研究也證實，將LMP1的反義核酸表達質粒轉染入鼻咽癌細胞中，能夠誘導細胞凋亡^[11]。

脫氧核酶(deoxyribozyme/DNAzyme)是利用體外分子進化技術獲得的一種具有催化功能的單鏈DNA片段，具有高效的催化活性和結構識別能力。自1994年Breaker等首次發現脫氧核酶以來，迄今為止已發現了多種不同類型的脫氧核酶^[26，27]。脫氧核酶化學本質為寡脫氧核苷酸，因而性質相對穩定。其結構特征為：分子量小，相對簡單。從酶學角度上，其對底物的趨近性好，催化效率和特異性高。在實際應用方面，脫氧核酶的副作用低，靶位點選擇的限制少，易于合成且價格低廉。設計不同的脫氧核酶可以切割任何mRNA，從而調控蛋白質的表達。作為一種新型的RNA水平強效基因滅活因子，脫氧核酶為治療腫瘤、病毒感染性疾病以及其它相關疾病提供了一條全新的策略^[28-30]。

申請人公開了如何通過利用生物信息學技術、二級結構預測軟件結合LMP1的功能域尋找靶位點，并構建靶向LMP1的脫氧核酶的方法。參考文獻31，本申請人具體公開了在B95-8細胞中篩選出3條有活性的脫氧核酶(DZ1、DZ7和DZ10)，能夠有效抑制LMP1的表達，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡^[31]。

其中3條有活性的脫氧核酶的DNA序列如下：

SEQ?NO.1：gcaaaggaaGGCTAGCTACAACGAagaggacaa(Dz1)

SEQ?NO.2：agggagtcaGGCTAGCTACAACGAcgtggtggt(Dz7)

SEQ?NO.3：cgtgttccaGGCTAGCTACAACGAggtcaggt(Dz10)

為了增加脫氧核酶在細胞內的穩定性，可以通過修飾的方法實現。現有技術中公開了對脫氧核酶進行修飾的方法，以避免脫氧核酶被酶解，參見文獻32，33。

另一方面，放射治療是腫瘤治療的主要方法之一，尤其對鼻咽癌病人的治療多以放射治療為主。但是長期放療易誘導放療抵抗^[17-19]。提高腫瘤病灶對放射的敏感性是提高放射療效的主要手段。