[發明專利]胰島素原C肽生物活性測定方法

無效

• 申請號: 200610030700.0
• 申請日: 2006-08-31
• 公開（公告）號: CN101135679A
• 公開（公告）日: 2008-03-05
• 發明（設計）人: 黃陽濱;孫九如;張翊;任軍;徐曉燕;應勖
• 申請（專利權）人: 上海新生源醫藥研究有限公司;上海新生源生物醫藥有限公司
• 主分類號: G01N33/15
• 分類號: G01N33/15;G01N33/68;G01N33/53;G01N21/76;A61K49/00;A61K38/28;A61D99/00
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技術領域

本發明涉及化學發光免疫法測定胰島素原C肽的生物學活性，并對該方法的測定范圍、精確性及線性進行了驗證。在此基礎上我們對自制活性標準品的規格進行標定。并建立中試產品活性質量標準。

背景技術

C肽是胰島素原分子中連接胰島素A鏈與B鏈的連接肽，由31個氨基酸組成，分子量為3020kD，是胰島素原轉變為胰島素過程中的裂解產物，與胰島素等分子從β細胞分泌。正常人基礎血漿C肽水平約為0.4nmol/L，I型糖尿病患者血漿C肽水平低于正常甚至測不出。早期研究認為C肽除輔助胰島素形成外，并無其他生物活性。90年代以來，以瑞典科學家Johansson和Wahren教授為首的研究小組發現C肽具有改善糖尿病遠期并發癥(包括糖尿病腎病)的作用。其作用機制與升高組織Na⁺-K⁺-ATP酶活性及激活內皮型一氧化氮合成酶促進一氧化氮合成有關。

(一)體外活性方法難以建立

在C肽生物活性方法的選擇上，我們首先根據C肽與細胞膜上G蛋白偶聯受體結合從而激活Na⁺-K⁺-ATP酶和內皮型NO合酶的作用機制，分別研究探討了通過測定紅細胞膜鈉鉀ATP酶活性或內皮型NO合酶活性來檢測C肽活性方法的可行性。

關于紅細胞膜Na⁺-K⁺-ATP酶活性方法，采用測定ATP被ATPase酶解后產生的無機磷的增加值，用分光光度法進行測定，檢測C肽對紅細胞處理前后血紅細胞Na⁺-K⁺-ATPase的活性。結果顯示，C肽對正常人血紅細胞Na⁺-K⁺-ATP酶活性有一定的促進作用，但即使C肽濃度在極高的時候，對紅細胞膜鈉鉀ATP酶活力的影響的差異也不明顯，說明正常人血紅細胞Na⁺-K⁺-ATPase對于C肽的作用不敏感，不成劑量依賴關系，重復性不佳。再者，紅細胞Na⁺-K⁺-ATPase必須在紅細胞膜上反應，操作比較難控制，不符合作為衡定產品批與批之間穩定性的檢測手段的要求，因此該方法不適合作為C肽的活性檢測方法。而關于使用內皮型NO合成酶活性方法直接檢測C肽活性，未見文獻報道。

可見，體外活性測定方法難以建立。我們嘗試選擇體內藥效學方法，作為C肽的生物學活性測定方法。

(二)結合體內藥效學方法，選擇作為生物活性方法的檢測指標

在體內藥效學試驗中，我們用糖尿病大鼠做模型，選擇低、中、高三個C肽劑量組，皮下注射給藥8周，檢測給藥前后眾多的血液、尿液生化指標、腎臟血流動力學指標及腎臟病理組織學檢查指標。其中生化指標包括血糖(GLU)和果糖胺(FMN)；甘油三酯(TG)及血總膽固醇(TC)；血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、腎小球肌酐清除率(Ccr)；血清總蛋白(T-P)和血清白蛋白(ALB)；U-TP排泄率、U-ALB排泄率和尿糖排泄率；凝血酶原時間(PT)、激活的部分凝血酶原時間(APTT)和凝血酶時間(TT)；血清MDA、NO和NOS，血清SOD水平；Na⁺-K⁺-ATPase活性。腎臟血流動力學指標包括腎臟/體重比值、腎小球濾過率(GFR)、血漿腎血流量(RPF)、濾過分數(FF)及腎血管阻力(RVR)和尿鈉排泄(U_NaV)。腎臟病理組織學檢查包括腎小球截面積、腎小球體積、囊腔面積和囊腔面積/腎小球截面積比值等。

對眾多的試驗結果進行分析，發現在腎臟血流動力學指標中的腎小球濾過率(GFR)是一個敏感指標，且存在較好的量—效關系。結合早期糖尿病腎病(如臨床I期、II期)的一個重要特征：腎小球濾過率(GFR)增高，一般GFR增加25-40％，可超過150ml/min，我們認為GFR是C肽生物活性的的較好體現者，確定以GFR作為生物活性方法的檢測指標，建立人胰島素原C肽在體生物活性檢測方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種準確性高，方便實用、成本低廉的凍干重組人胰島素原C肽生物活性的測定方法。