[發明專利]一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒

無效

• 申請號: 200610029348.9
• 申請日: 2006-07-25
• 公開（公告）號: CN101113465A
• 公開（公告）日: 2008-01-30
• 發明（設計）人: 李曉虹;韓偉;閻東麗
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 上海浦東良風專利代理有限責任公司
• 代理人: 張勁風

技術領域：本發明涉及一種檢測樣品中細菌的試劑盒，特別涉及一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒。

背景技術：單核細胞增生李斯特氏菌(簡稱單增李斯特菌L?monocytogenes)是一種人畜共患致病菌，可使人和動物患腦膜炎、腦炎、敗血癥及造成懷孕婦女流產、死胎等疾病，死亡率高達30～70％。該病廣泛存在于土壤、人和動物的糞便中，很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病大爆發。近年來已有不少國家報道了由于污染單增李斯特菌發生的食物中毒事件。早在1929年，就有報道該菌對人有致病性，最嚴重的一次是1985年在美國加里福尼亞地區，應食用乳酪引起的單增李斯特菌食物中毒。目前該菌每年在美國已成為由食物污染引起死亡的四大病原菌之一。此外由于該菌在4℃冰箱保存的食品中也可生長繁殖，故其危害性進一步增大。因此世界各國政府部門對其菌越來越重視，紛紛制定一些新的食品安全法規，并把單增李斯特菌納入法定強檢項目。我國每年大量進口水產品，加入WTO以來，進出口貿易呈直線上升態勢，傳統的單增李斯特菌檢驗方法，檢驗周期冗長，至少需要5～14d才能得出結果，步驟繁瑣且檢驗精度低。為了適應對外貿易發展的新需要，實現與國際檢測技術接軌，有必要建立一種簡便、快速、準確的檢出方法，以更好的為檢驗檢疫事業服務。

近年來，國內外的研究人員建立了多種快速檢測食品中單增李斯特菌的方法，包括商海濤等的“李斯特氏菌因子血清的制備及食品檢測的免疫磁性分離-PCR(MIPA)方法的建立”(中國獸醫學報，1999，19(4)：339-343)、寇運同等.的“用免疫磁珠捕集法快速檢測食品中的單核細胞增生李斯特菌”(檢驗檢疫科學，2001，11(6)：12-13)、O‘Connor等的PCR/DNA探針方法、孫煥冬等“半套式聚合酶鏈反應檢測牛奶中部分腸道致病菌”(職業與健康，2002，18(3)：43-44)等方法。上述方法樣品均需前增菌，延長了檢出的時間且檢測的靈敏度低。還沒有解決快速檢出單增李斯特菌的問題。

隨著分子生物學技術的發展，聚合酶鏈反應(PCR)技術在國際上得到了越來越廣泛的應用，不少用PCR檢測致病菌的方法已十分成熟，并在某些國家成為官方認可的方法。

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其它物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。

PCR-ELISA技術的原理是PCR?5’端標記上地高辛或生物素等非放射性標記物，擴增產物滴加到固定有特異性探針的微孔板上，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物，最終加底物顯色。在酶標板上測定OD值判定結果。根據內標的讀數作出標準曲線，并利用標準曲線讀出樣品單增李斯特菌的含量。本發明采用PCR-ELISA方法，利用單增李斯特菌毒力簇金屬蛋白酶基因(mpl)作為PCR的靶基因，應用地高辛標記的DIG-PCR-ELISA技術進行檢測單增李斯特菌的研究。

發明內容：本發明的目的是提供一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒，以便可以快速、靈敏、準確地檢出樣品中單增李斯特菌，適合于各種樣品的大批量檢測。本發明的技術方案為：本發明的試劑盒主要由以下幾種試劑配方組成：

試劑A：DNA提取液；

試劑B：PCR引物和探針；

試劑C：PCR反應液，其中含有特定一對引物(LM1；5’端被地高辛標記的LM2)，其序列分別為：5’-GAAAAAGCATTTGCCAT-3’和5’-GCAACTTCCGGCTCAGC-3’；

試劑D：ELISA反應液(1.結合buffer；2.生物素標記的捕獲探針LM4和IS5；3.變性液；4.雜交液；5.洗液I；6.anti-DIG-POD；7.洗液II；8.顯色底物A；9.顯色底物B；10.終止液)，其中5’端被生物素標記的探針LM4和IS5序列分別為：5’-GGTCAGAGTGAAGCTCATGT-3’和5’-TACGTACTCTCGATCACGTC-3’。