[發明專利]對鱗翅目害蟲高效的蘇云金芽孢桿菌菌株及其殺蟲基因和應用

無效

• 申請號: 200610022151.2
• 申請日: 2006-10-31
• 公開（公告）號: CN101074427A
• 公開（公告）日: 2007-11-21
• 發明（設計）人: 李平;譚芙蓉;鄭愛萍
• 申請（專利權）人: 李平;譚芙蓉;鄭愛萍
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/32;C07K14/325;A01N63/00;A01P7/04;C12R1/07
• 代理公司: 成都天嘉專利事務所
• 代理人: 趙麗

技術領域

本發明屬于生物防治技術領域，具體的，本發明涉及一株含有多種cry基因的蘇云金芽孢桿菌菌株Rpp02，它至少具有cry1Ac、cry1Ab、cry1C以及cryV重要殺蟲基因的優良組合，對農業生產中的一些主要害蟲，特別是蔬菜、棉花、玉米、水稻、以及森林等鱗翅目害蟲具有較高的活性。進一步，本發明涉及對鱗翅目有高毒力的Bt?cry1Ac基因的核苷酸序列和其編碼的蛋白質氨基酸序列，涉及在植物中表達的穿梭表達載體pCA-1Ac。

背景技術

在農業生產過程中，蟲害是造成農業生產損失的一個重要因素，據FAO統計，全世界農業生產每年因蟲害造成的經濟損失高達14％，病害損失達12％，草害損失達11％。損失額高達1260億美元，相當于中國農業總產值的一半，英國的4倍多。為了減少這些損失，普遍采用化學防治手段進行防治，但由于化學農藥的長期、大量使用，造成了對環境的污染，農副產品中農藥殘留量增加，給人類的生存和健康帶來了危害。此外，化學農藥在殺滅害蟲的同時，也殺傷了天敵及其它有益物，破壞了生態平衡。與化學防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特點。并且避免了化學防治帶來的一系列問題。因此，生物防治技術成了人們研究的熱點。在生物殺蟲劑中，蘇云金芽孢桿菌是目前世界上用途最廣、產量最大的一類微生物殺蟲劑。

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性細菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時可形成具有殺蟲活性的由蛋白質組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白(Insectididal?crystal?proteins，簡稱ICPs)，ICPs是由cry基因編碼的，對敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。近幾十年來，Bt已廣泛應用于控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲。此外，Bt還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種害蟲及植物病原線蟲、螨類、原生動物有控害作用。目前在農田害蟲、森林害蟲及衛生害蟲的防治中Bt已成為化學合成農藥的有力替代品，Bt還是轉基因抗蟲工程植物重要的基因來源。

自1981年Schnepf從菌株HD-1Dipel中克隆了第一個能表達殺蟲活性的基因以來(Adang?M.J?et?al，Characterized?full-length?and?truncated?plasmid?clones?of?the?crystalprotein?of?Bacillus?thuringiensis?subsp.kurstaki?HD-73?and?their?toxicity?to?Manduca?sexta，Gene，1985，36(3)：289～300.)，人們已經分離克隆了300多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類(Crickmore?N，Zeigler?D?R，Feitelson?J，et?al.Revision?of?the?nomenclature?for?the?Bacillusthuringiensis?pesticidal?crystal?proteins.Microbiol?Mol?Biol?Rev，1998，62：807-813；http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。其中cry1類是一群同源性較高的基因，它們編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD，對鱗翅目害蟲有特異毒性，并且許多基因目前已被廣泛應用于植物的抗蟲基因工程研究中，轉基因植物已獲得較好的抗蟲性(Kozie?M?G，Beland?G?L，Bowman?C，et?al.Field?performance?of?elite?transgenic?maizeplants?expressing?an?insecticidal?protein?derived?from?Bacillus?thuringiensis.Bio/Technology，1993，11：194-200；Perlak?FJ，Deaton?R?W，Armstrong?T?A，et?al.Insect?resistant?cotton?plants.bio/technology，1990；8：939-943；黃其満，毛立群，黃衛紅等，轉人工GFM?cry1A基因煙草表現明顯殺蟲活性。植物學報，1998，40：228-233)。Cry1Ac基因最初由Adang?MJ和Staver?MJ等人克隆，他們發現蘇云金芽孢桿菌菌株HD-73產生的晶體蛋白對鱗翅目幼蟲有極高的毒力，并將編碼此晶體蛋白的基因從75kD的質粒上分離克隆出來。由于cry1Ac基因編碼的晶體蛋白對鱗翅目中的粉紋夜蛾、煙芽夜蛾以及棉鈴蟲的毒力是最高的，所以有不少實驗室都在對其進行研究。孫明、吳嵐等人于1995年從菌株218中克隆了我國第一個cry1Ac基因，被國際命名委員會命名為cry1Ac10(孫明等，蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因cry218的克隆和表達，農業生物技術學報，1996)。1996年郭三堆等人將人工合成的調控序列和cry1Ac基因成功地導入多個棉花栽培品種，使我國成為國際上第二個獨立開發成功轉基因抗蟲棉并獲得知識產權的國家(崔洪志，郭三堆，中國農業科學，1996，29(1)：93)。多年來，有關高毒力和新型殺蟲活性的cry基因的開發和研究一直是國內外對Bt基因研究和利用的熱點。