[發明專利]水泡口炎病毒M蛋白DNA制劑及其制備方法與應用

無效

• 申請號: 200610021951.2
• 申請日: 2006-09-27
• 公開（公告）號: CN101049506A
• 公開（公告）日: 2007-10-10
• 發明（設計）人: 魏于全;文艷君
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 成都科海專利事務有限責任公司
• 代理人: 岳英

1.一種水泡口炎病毒M蛋白DNA制劑，其特征在于：由組分A和組分B組成，組分A是由表達M蛋白的真核質粒以1-5mg/ml的濃度溶于蒸餾水或者含5-50mmol/l?Tris和0.5-5mmol/l?EDTA的緩沖液中構成；B組分由DOPE和DOTAP合成的脂質體以0.5-5mg/ml的濃度溶于10％的左旋葡萄糖溶液或者蒸餾水中構成，使用前將組分A和組分B以1∶1-10的質量比混合即得。

2.根據權利要求1所述的水泡口炎病毒M蛋白DNA制劑的制備方法，其特征在于：

(1)水泡口炎病毒M蛋白基因的獲得：用Indiana株VSV感染BHK-21細胞，24小時后收集細胞，提取細胞總RNA作為逆轉錄-聚合酶鏈式反應即RT-PCR的模板，設計并合成相應的引物，通過RT-PCR擴增得到水泡口炎病毒M蛋白的cDNA，即瓊脂糖電泳凝膠上690bp的片段，回收該片段得到水泡口炎病毒M蛋白基因；

(2)水泡口炎病毒M蛋白真核表達質粒的構建：將得到的M蛋白基因和真核表達載體進行酶切連接反應，轉化大腸桿菌，篩選重組子經酶切、測序鑒定正確后得到水泡口炎病毒M蛋白真核表達質粒；

(3)水泡口炎病毒M蛋白體外表達：采用Invitrogen公司的Lipofectamine?2000將M蛋白真核表達質粒轉染到COS-7細胞中，轉染后48-72h，收集細胞做Western?blot鑒定重組質粒的體外表達；以未轉染的COS-7細胞作為陰性對照，通過免疫印跡實驗證實所構建的水泡口炎病毒M蛋白重組質粒能夠在真核細胞中表達M蛋白；

(4)M蛋白DNA制劑的制備：組分A：擴增M蛋白真核表達質粒，以GE?Healthcare商品化的凝膠純化質粒，最終將質粒以1-5mg/ml的濃度溶于蒸餾水或者含5-50mmol/l?Tris和0.5-5mmol/l?EDTA的緩沖液中；組分B：以DOPE及DOTAP為主要成分，制備脂質體，脂質體最終以0.5-5mg/ml的濃度溶于10％的左旋葡萄糖溶液或者蒸餾水中，使用前將組分A和組分B以1∶1-10的質量比混合，并輕輕振蕩混勻，靜置5-30分鐘使用。

3.根據權利要求1所述的水泡口炎病毒M蛋白DNA制劑的應用，其特征在于：生產直接用于抑制腫瘤的發生、發展和轉移，并誘導腫瘤細胞的凋亡，用于抗腫瘤制劑的藥物的應用。