[發明專利]一種抑制core1 β1－3半乳糖基轉移酶的shRNA表達載體的構建方法及應用

有效

• 申請號: 200610019901.0
• 申請日: 2006-08-03
• 公開（公告）號: CN101205542A
• 公開（公告）日: 2008-06-25
• 發明（設計）人: 章曉聯;周霞
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C07H21/04;C12N1/19;A61K48/00;A61P37/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于分子免疫領域。具體涉及一種能抑制core1β1-3半乳糖基轉移酶的shRNA表達載體的構建方法，同時還涉及該shRNA真核表達質粒對T細胞活化抑制作用的用途。

背景技術

免疫抑制劑在器官移植中用于防治排斥反應，即干擾受體對外來抗原的識別和對非自身細胞的清除。常用的免疫抑制劑有環孢素、腎上腺皮質激素、烷化劑和抗代謝藥。這些藥物的特點是選擇性差，對正常和異常的免疫反應均有抑制作用(崔嵐，邱麗珍；免疫抑制劑在器官移植中的研究進展；中國藥房；2001，01，52-53)。蛋白質糖基化是蛋白質翻譯后的一種重要的加工過程。在肽鏈生物合成的同時或合成后在酶的催化下糖鏈被連接到肽鏈的特定糖基化位點。根據其肽鏈的糖基化位點不同分為N-糖基化和O-糖基化。通過連接GalNAc殘基而對蛋白質上的絲氨酸和蘇氨酸進行的修飾產生了O-聚糖(O-glycan)(Schachter?H.，Brockhausen?I.The?biosynthesis?of?serine(threonine)-N-acetylgalactosamine-linkedcarbohydrate?moieties，in：H.J.Allen，E.C.Kisailus(Eds.)，Glycoconjugates.Composition，Structure?and?Function，Marcel?Dekker，New?York，NY，1992，pp.263-332.)。在多肽GalNAcT作用下產生的O-聚糖有4種共同的核心(core)亞型，即core1，core2，core3，core4。目前的研究表明O-聚糖的表達與免疫系統密切相關，直接影響到T細胞的發育，免疫應答的發生以及某些疾病的發生等(Zhang?XL.Roles?of?glycans?and?glycopeptides?in?immune?system?and?immune-related?diseases.Current?Medical?Chemistry.2006；13：1141-1147.)。Core1?O-聚糖表達于大量組織細胞表面，改變組織細胞表面的糖后減弱了對T細胞的活化。Core1?O-聚糖合成過程中的關鍵酶是core1β1-3半乳糖基轉移酶(C1GalT)。運用siRNA真核表達載體合成siRNA分子的優點在于：能夠穩定地抑制目的基因表達，引起基因沉默(Brummelkamp?TR，Bernards?R，Agami?R.A?system?for?stable?expression?of?shortinterfering?RNAs?in?mammalian?cells.Science.2002，296(5567)：550-553.)。

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種抑制core1β1-3半乳糖基轉移酶的shRNA真核表達載體的構建方法，該表達載體能特異性抑制基因的表達，具有高效性、高穩定性、高特異性的優點。此質粒表達的ShRNA能在體內抑制T細胞的活化，抑制細胞免疫功能。

本發明的另一個目的在于提供一種抑制core1β1-3半乳糖基轉移酶的shRNA真核表達載體在作為制備治療或預防移植排斥反應藥物中的應用。

本發明的再一個目的在于提供一種抑制core1β1-3半乳糖基轉移酶的shRNA真核表達載體在作為制備免疫抑制劑中的應用。

本發明的再一個目的在于提供一種抑制core1β1-3半乳糖基轉移酶的shRNA真核表達載體在制備抑制T細胞活化的藥物中的應用。

本發明的再一個目的在于提供一種抑制core1β1-3半乳糖基轉移酶的shRNA真核表達載體在制備抑制細胞免疫功能的藥物中的應用。

為了實現上述目的，本發明采取以下技術方案：

(一)能有效抑制小鼠C1GalT基因表達的shRNA真核表達載體pu6-shRNAe的構建。

(二)pu6-shRNAe真核表達載體的鑒定。

(三)體外檢測pu6-shRNAe對細胞C1GalT基因表達的抑制。

(四)通過肌肉注射pu6-shRNAe質粒，構建C1GalT基因knockdown動物模型，觀察此動物抗傷寒能力及抗感染能力的改變。

本發明與現有的細胞免疫抑制劑相比，具有以下優點：能特異性抑制T細胞的活化，而不改變T細胞本身的功能，能針對性地改變移植宿主對移植器官的識別及排斥反應。

附圖說明

圖1.小鼠pu6-shRNAe真核表達載體的構建