[發明專利]PRRSV和PCV－2二聯重組雞痘活載體疫苗

無效

• 申請號: 200610017044.0
• 申請日: 2006-07-26
• 公開（公告）號: CN101112621A
• 公開（公告）日: 2008-01-30
• 發明（設計）人: 金寧一;沈國順;李昌;金擴世;魯會軍;金洪濤;李霄;田明堯
• 申請（專利權）人: 金寧一
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/275;A61P11/00;A61P15/00;C12N15/863
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 白冬冬

技術領域：

本發明屬于生物技術領域。

背景技術：

PRRS(豬繁殖與呼吸綜合癥)是由PRRSV(豬繁殖與呼吸綜合癥病毒)引起的豬的烈性傳染病之一。被國際獸醫局列為B類動物傳染病，主要引起母豬繁殖障礙(如流產、早產、死胎、木乃伊胎)和仔豬呼吸道癥狀。

目前世界上發生的PRRS有兩個血清型：歐洲型和美洲型。到目前為止我國流行的只有美洲型。由于PRRS主要是引起母豬的繁殖障礙，從而給我國養豬業造成了巨大的經濟損失。

PRRSV動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬，是不分節段的單股正鏈RNA病毒。基因組長約15Kb，具有感染性，含有8個開放閱讀框(ORF)。

其中ORF3和ORF5是主要的結構蛋白基因，分別含有765、605個核苷酸，編碼的糖蛋白GP3、GP5分別為255、200個氨基酸，是PRRFV主要的免疫原。即可誘導體液免疫，又可誘導細胞免疫。

豬圓環病毒(PCV)屬于圓環病毒科圓環病毒屬。是圓環病毒屬的代表種，它是一種小而無囊膜、二十面體對稱、共價閉合、環狀、單股DNA病毒，病毒粒子直徑平均為17nm，是目前獸醫學上發現的最小的動物病毒。

PCV可分為兩個血清型，即PCV-1和PCV-2。PCV-1對豬無致病性，為非致病性PCV，PCV-2對豬有致病性，可引起PMWS(斷奶仔豬多系統衰竭綜合征)，又稱PMWS相關PCV。1991年加拿大首次爆發該病，隨后世界上許多國家和地區都有該病的報道，目前我國的很多豬場均有該病存在，給我國的養豬業造成嚴重的經濟損失。

Hamel等通過對PCV基因組分析，發現PCV-1和PCV-2均可能含有11個開放閱讀框(ORF)。PCV各閱讀框中，ORF1和ORF2為主要閱讀框，現已證實ORF1編碼是與病毒復制相關的Rep蛋白，而ORF2是編碼病毒的主要結構蛋白，也是病毒的保護性抗原。

PCV-2的ORF2基因編碼病毒核衣殼蛋白(Cap)。Liu等將ORF2基因連接到MBP-His(8)-tag基因3’端，在細菌中表達ORF2融合蛋白，發現該融合蛋白可被抗PCV2多克隆抗體和PCV2感染豬血清識別，表明ORF2蛋白與PCV2的免疫反應性有關。Truong等用從實驗性感染豬制備的PCV2抗血清，建立ELISA方法，發現PCV2-ORF2編碼蛋白具有與抗原性相關的線性表位，其中從69-83和117-131殘基的兩個抗原表位對PCV2來說具型有特異性，ORF2抗原表位可以作為PCV2感染的血清學標志以檢測PCV2抗體效價。

PRRSV和PCV-2是目前嚴重威脅養豬業發展的兩種重要的病毒。由于這兩種病毒常常混合感染，結果使疫情加重。目前對這兩種病毒性疾病的控制尚無切實有效的方法，防制PRRS的疫苗主要有滅活苗和弱毒苗，但由于免疫原性和安全性等方面的問題受到限制。而對PCV-2的控制目前尚無疫苗。因此發展新型疫苗來控制PRRSV和PCV-2已是當務之急。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種可作為預防我國PRRS和PCV-2感染的活載體疫苗，表達PRRSV結構糖蛋白ORF5、ORF3基因、PCV-2核衣殼蛋白ORF2基因的PRRSV和PCV-2二聯重組雞痘活載體疫苗。

本發明的具體方法是：

a、用PCR方法擴增了PRRSV長春株ORF5、ORF3基因和PCV2內蒙株ORF2基因，并將其克隆到pMD18-T載體，構建了pMD18T-ORF2、pMD18T-ORF5、pMD18T-ORF3質粒；

b、將PRRSV的ORF5-ORF3融合后的基因，插入到雞痘病毒表達載體pUTAL復合啟動子ATI-P7.5×20下游，同時將PCV2的ORF2基因插入到串聯啟動子P7.5×16下游，構建含PRRSV的ORF5-ORF3和PCV2的ORF2基因的重組雞痘病毒轉移質粒pUTAL-ORF2-ORF5-ORF3。

本發明由上述方法所獲得的含PRRSV的SEQ?ID?NO：1和SEQID?NO：2以及含PCV2的SEQ?ID?NO：3基因的重組雞痘病毒轉移質粒pUTAL-ORF2-ORF5-ORF3。

本發明的優點和積極效果為：

1、本發明得到的重組雞痘病毒rFPV-ORF2-ORF5-ORF3可同時表達PRRSV結構蛋白基因ORF5、ORF3和PCV2核衣殼蛋白基因ORF2；該重組雞痘病毒表達的蛋白可與PRRSV、PCV2抗體發生特異性反應。