[發明專利]乳腺癌單抗M4G3單鏈抗體的制備及其DNA序列

無效

• 申請號: 200610015720.0
• 申請日: 2006-09-22
• 公開（公告）號: CN101148670A
• 公開（公告）日: 2008-03-26
• 發明（設計）人: 牛瑞芳;張霖;王德發;史玉榮;魏熙胤;楊毅;黃建英;牛昀;孫保存;郝希山
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學附屬腫瘤醫院
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C07K16/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

[技術領域]

本發明屬于生物技術領域，具體的說制備出一種用于乳腺癌靶向治療的鼠源性單鏈抗體(M4G3-scFv)并確定其DNA序列。

[背景技術]

鼠源性單克隆抗體M4G3是人乳腺癌特異性抗體。經免疫病理學研究表明，其與臨床病理診斷符合率為94％，并可鑒別診斷分化不良、來源不明的癌轉移淋巴結。用共沉淀法制成的磁性毫微囊(MNP)耦聯抗腫瘤藥物阿霉素、表阿霉素、氨甲喋呤等進行體外抑瘤實驗表明，其殺瘤率顯著提高，且抗體活性保留80％以上。但是，由于M4G3單抗是鼠源性單抗，分子量較大，長期反復使用時可誘發人體產生抗鼠的抗體，發生過敏反應(HAMA)，因此在乳腺癌的臨床應用中受到一定的局限。

[發明內容]

為了克服這一缺欠，利用基因工程抗體技術將編碼M4G3單抗的輕重鏈可變區的DNA序列進行擴增，并構建了可表達單鏈抗體(M4G3-scFv)的相關載體。成功地將鼠源性單克隆抗體M4G3改造成單鏈抗體(M4G3-scFv)。由于單鏈抗體僅有M4G3單抗的V區而去掉了恒定區(C區)，因此既保存了M4G3單抗的結合特點，又大大降低了其免疫原性，并且穿透力增強，容易進入局部組織尤其是實體瘤中發揮作用?？寺∮蠱4G3-scFv序列的表達載體可以在宿主菌中表達M4G3-scFv單鏈抗體，為單鏈抗體的大批量生產提供了條件。

本發明是這樣實現的。從M4G3單抗雜交瘤細胞中提取總RNA，分別擴增重鏈可變區基因(VH)與輕鏈可變區基因(VL)，通過一段靈活的連接肽序列連接形成一個單鏈抗體(ScFv)融合基因，與表達載體pCANTAB5E重組，置于Lac啟動子/控制子調控之下，并位于M13噬菌體pIII先導序列和pIII基因之間，與輔助噬菌體M13KO7一起在大腸桿菌TG1中表達，組裝成ScFv，以融合蛋白的形式表達在噬菌體表面。采用細胞淘選法，利用pIII融合蛋白進行淘選，野生型pIII蛋白進行再感染，共進行三輪淘選，從中挑選重組陽性克隆，鑒定并測序。

本發明制備出單鏈抗體(M4G3-scFv)并確定其DNA序列。此單鏈抗體編碼M4G3單抗的重鏈可變區DNA序列375bp，編碼M4G3單抗的K輕鏈可變區DNA序列321bp，以及編碼M4G3-scFv單鏈抗體的DNA序列全長為741bp。

1、編碼M4G3單抗的重鏈可變區DNA序列375bp，序列為：(見說明書序列表)

2、編碼M4G3單抗的K輕鏈可變區DNA序列321bp，序列為：(見說明書序列表)

3、編碼M4G3-scFv單鏈抗體的DNA序列全長為741bp，序列為：(見說明書序列表)

[附圖說明]

圖1為鼠源性抗乳腺癌單鏈抗體(M4G3-scFv)的乳腺癌組織免疫染色反應

圖2為大量制備可溶性M4G3-scFv的western?blot鑒定

[具體實施方法]

下面對本發明作詳盡描述：

實驗材料：

1、鼠源性乳腺癌特異性單抗M4G3雜交瘤細胞

2、Expression?Module(recombinant?phage?antibody?system)PHARMACIA?BIOTECH

3、M-MulV逆轉錄酶；Taq?DNA聚合酶；限制性核酸內切酶Sfi?I/Not?I(Takara)

4、M4G3單抗陽性的乳腺癌細胞系T47D

實驗步驟：

參見PHARMACIA?BIOTECH(27-9401-01)試劑盒說明書

1、輕鏈、重鏈可變區的擴增：鼠源性乳腺癌特異性單抗M4G3雜交瘤細胞的培養→提取總RNA→反轉錄成cDNA→用輕鏈、重鏈引物(試劑盒提供)擴增L-DNA和H-DNA

2、ScFv融合基因的克隆：用Linker(試劑盒提供)進行重疊PCR將L-DNA和H-DNA連接起來→PCR擴增ScFv融合基因→Sfi?I/Not?I酶切→連入pCANTAB5E載體，位于M13噬菌體pIII先導序列和pIII基因之間→轉化感受態細胞TG1

3、陽性噬菌體抗體庫的淘選：選擇轉化的細菌，添加M13K07輔助噬菌體，共培養釋放噬菌體，用M4G3單抗陽性的乳腺癌細胞系T47D淘選表達M4G3-scFv的噬菌體，共3次。

4、陽性克隆的鑒定：經過3次淘選得到的噬菌體感染大腸桿菌TG1，提取噬菌粒，測序鑒定。

以乳腺癌病理切片為靶抗原，陽性噬菌體為一抗，辣根過氧化物酶標記的抗噬菌體抗體為二抗，進行酶免染色。