[發明專利]一種L－山梨糖脫氫酶及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 200610012805.3
• 申請日: 2006-06-09
• 公開（公告）號: CN101085987A
• 公開（公告）日: 2007-12-12
• 發明（設計）人: 賈茜;吳洪濤;郝愛魚;金奇;修建新;衛燦東;劉愛兵;耿文飛;祝仕清;楊麗霞;孫君偉;楊帆;米造吉
• 申請（專利權）人: 華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04;C12N15/63;C12P7/60
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因工程領域中一種L-山梨糖脫氫酶(SDH)、其編碼基因、表達方法與應用。

背景技術

目前已知多種微生物可以將L-山梨糖轉化為2-酮基-L-古龍酸(2-KGA)，而2-KGA是維生素C生產的重要中間體，一些報道用微生物細胞裂解液將L-山梨糖轉化為L-山梨酮。如美國專利3912592中報道氧化葡萄糖酸菌，假單孢菌，ACINETOBACTER桿菌，八疊球菌，鏈霉菌，SERRATIA，氣桿菌，分支桿菌及擬青霉菌都有這樣的轉化特性。最早由Makover等(biotechnol?bioeng171485-1514，1975)描述了假單孢菌PUTIDA?ATCC?21812中的酶的特性，但未分離純化。KITAMURA等(biotechnol?bioeng?17349-359，1975)報告了氧化葡萄糖酸菌(IFO3293)中SDH活性被PMS(phenazine?methosulfate)、亞甲基藍或鉀鐵氰化物等電子受體激活，但同樣也未分離到此酶。在美國專利4916069(FUJIWARA等)從氧化葡萄糖酸菌中分離到SDH為膜結合蛋白，分子量約為58000，為單個分子，在輔酶存在下能氧化L-山梨糖至L-山梨酮，具有底物專一性。美國專利5753481(后續申請5861292，6197562)(NIWA等)由氧化葡萄糖酸菌T-100膜蛋白中分離到SDH及其基因，其分子量為58000，N端氨基酸序列為THR-SER-GLY-PHE-ASP-TYR-ILE-VAL-VAL-GLY-GLY-GLY-SER-ALA-。用E.COLI表達該基因得到的產物具有轉化活性。在美國專利5437989(ASAKURA等)中稱在氧化葡萄糖酸菌DSM4025FERM?BP-3812分離到與乙醇/醛脫氫酶同源的酶，在電子受體存在下，能將L-山梨糖轉化為2-KGA。該酶分子量為130000/140000(凝膠過濾法測定)，由兩個分子量分別為62,500-66,500daltons和60,500---64,500daltons的不同亞基組成。在文章“L-山梨糖脫氫酶的純化及性質研究”(薛震役等)(《微生物學通報》2000年27(2))對氧化葡萄糖酸菌SCB329中的SDH進行了提純，但即未進行蛋白組成分析，也沒有進行L-山梨糖到L-山梨酮或L-KGA的轉化實驗。

發明創造內容

本發明的目的之一在于提供一種新的編碼L-山梨糖脫氫酶的基因；

本發明的另一個目的在于提供上述基因編碼的多肽；

本發明的另外一個目的在于提供上述序列的表達載體；

本發明的最后一個目的在于提供上述基因的用途。

根據本發明的一個方面，編碼L-山梨糖脫氫酶的基因是從酮古龍酸菌(Ketogulonigenium?sp.)WB0104(CCTCC?No.M203094)中分離得到的(SEQ?IDNO：1)，該基因的ORF長為1737，編碼579個氨基酸的蛋白(SEQ?ID?NO：5)與所有已知基因氨基酸水平同源性最高為來源于Pseudogluconobactersaccharoketogenes??的乙醇脫氫酶，同源性為53％。SEQ?ID?NO：5與SEQ?ID?NO：6、SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8的同源性分別為68％，67％，67％。

具體地說，本發明提供了新的分離的多核苷酸，其含有下述序列之一：

(1)序列表中的SEQ?ID?No：1所示的序列；

(2)編碼序列表中SEQ?ID?No：5所示蛋白質序列的多核苷酸序列。

上述涉及的多核苷酸還包括取代、缺失、和插入變體以及等位變體、剪接變體、片段、衍生物等，其中可以通過取代、缺失、插入或衍生一個或多個核苷酸。優選的這些多核苷酸是那些編碼具有生物學活性的SDH的多核苷酸。

本領域技術人員可以理解的是，上述的分離的多核苷酸也包括那些與SEQID?NO.1所示序列具有較高同源性的序列，例如同源性大于90％、甚至95％、甚至98％的序列；還包括那些在嚴謹條件下可與SEQ?ID?NO.1所示序列雜交的序列；或者可與上述序列互補的序列。