[發明專利]應用生物反應器大規模生產流感疫苗的方法

無效

• 申請號: 200610011773.5
• 申請日: 2006-04-24
• 公開（公告）號: CN101062411A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 張玉慧
• 申請（專利權）人: 江蘇延申生物科技股份有限公司
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145;A61P31/16;C12M3/02;C12M1/02
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司
• 代理人: 林倩

技術領域

本發明涉及一種應用生物反應器大規模生產流感疫苗的方法。

背景技術

目前獲得批準生產的流感疫苗仍是雞胚來源的滅活疫苗，但其仍存在許多不足，如，雞胚連續傳代后常常引起毒株變異；雞胚有可能存在外源病毒因子的污染；用雞胚生產流感疫苗不能滿足應急情況下的需要，尤其是禽流感的爆發，也會影響雞胚的正常供應。因此，世界衛生組織敦促世界各國尋找對流感病毒敏感的細胞株大規模生產流感疫苗的方法。中國專利號為02112013.7的發明專利說明書公開了一種大規模連續生產病毒疫苗的方法，該方法包括下列步驟：a)在具有固定床籃式攪拌系統的Celligen?Plus⑧生物反應器中，以聚酯切片Fibra-CelTMDisks為載體，培養細胞生產病毒；b)在細胞生長至一定密度時，接種所述病毒，使所述病毒感染細胞；c)使病毒在合適的條件下大量增殖；d)經純化后收獲病毒。這是一種利用細胞培養技術生產病毒疫苗的方法，具有培養的細胞密度高、可連續培養和病毒產量高等優點，實現了工業化生產疫苗的目的。由于細胞培養技術中，病毒吸附到細胞上繁殖，上述狂犬，出血熱、乙腦、小兒脊髓灰質炎病毒容易吸附在細胞上，所以上述方法正如文中所提出的適合于狂犬疫苗、出血熱疫苗、乙腦疫苗、小兒脊髓灰質炎疫苗和輪狀病毒疫苗的制備，而流感病毒未經Vero細胞適應采用上述專利中所提出的方法生產流感疫苗是困難的，這也就是至今流感疫苗還是借助雞胚制備而不能應用生物反應器大規模生產流感疫苗的原因。

發明內容

本發明的目的在于提出一種適應工業化生產的應用生物反應器大規模生產流感疫苗的方法。

本發明采取如下方法：

將流感當年流行毒株在Vero細胞上進行適應傳代，經傳代適應的病毒毒種保存于-70℃以下待用；在生物反應器中加入微載體，接種Vero細胞，待Vero細胞生長至一定密度時接種上述流感毒種，使病毒在合適的條件下大量增殖，將收獲的病毒液經滅活、濃縮、純化及裂解，根據純化的單價原液的血凝素含量，配制成三價流感疫苗半成品。

上述流感流行毒株在Vero細胞上的適應傳代采取如下措施：將細胞Vero置于培養器皿中用EDTA或胰蛋白酶消化傳代，細胞長成單層后，倒掉生長液，用Hank’s液或PBS將細胞表面清洗1～2遍，接種流感毒種，加入含一定濃度的胰蛋白酶的維持液后培養，收獲前將細胞凍融1～2次，按上述同樣方法繼續傳代。

所采用的生物反應器為固定床籃式攪拌反應器，載體是片狀載體，其成分是聚酯纖維。

所采用的生物反應器為懸浮培養反應器，微載體是葡聚糖聚合物。

本發明采用將流感毒種在非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)上進行傳代適應，在適當濃度的裂解劑的作用下，流感病毒對Vero細胞感染能力增強，并很快適應Vero細胞，然后將在Vero細胞適應的流感毒種接種到在生物反應器已增殖到10⁷個/ml以上細胞密度的Vero細胞中，調節反應器各種控制參數，如攪拌速度、PH值、D0值、灌流速度等，使病毒在高細胞密度的生物反應器中高校繁殖，并連續灌流，收獲病毒液，然后進行病毒的滅活、濃縮、純化、裂解等步驟制成流感疫苗。

本發明的應用生物反應器大規模生產流感疫苗，解決了以往采用雞胚生產流感疫苗所存在的外源病毒污染難以控制、付反應大、成本高、生產規模不易擴大的缺點，它具有安全有效、抗原量高、質量穩定、易于擴大規模等優點。

具體實施方式

實施例1

流感疫苗的制備方法如下：

在流感疫苗的的制備中，首先要解決的是流感病毒適應Vero細胞，這是本制備方法的關鍵，采取如下步驟：從種子細胞庫中復蘇一支Vero細胞，將細胞加入有生長液的細胞培養器皿中，生長液是MEM或M199+8％牛血清PH7.0～7.2，37℃培養48小時長成單層后，倒掉生長液，用Hank’s液將細胞表面清洗1～2遍，將生長液中殘余的牛血清洗凈(由于牛血清中含有流感病毒的非特異性抑制素，會影響流感病毒的復制)，接著接種流感毒種，置33～35℃吸附1-2小時，然后加入維持液，維持液采取無血清培養基(含1～5μg/ml胰蛋白酶)，加胰蛋白酶的目的是為了提高流感病毒在細胞中的復制能力，經33-35℃培養三天收獲，收獲前將細胞凍融1-2次，細胞破裂病毒釋放，可提高收獲液的病毒滴度。按同樣的方法將流感毒種繼續傳代，經6～8代收獲，病毒血凝滴度穩定到1∶320，將毒種保存于-70℃以下待用。通過上述方法獲得的病毒已適應Vero細胞。