[發明專利]含有假異胞嘧啶核堿基衍生物的3’修飾寡核苷酸及其作為引物或探針的應用

無效

• 申請號: 200580049701.3
• 申請日: 2005-04-14
• 公開（公告）號: CN101171343A
• 公開（公告）日: 2008-04-30
• 發明（設計）人: 馬兆春;K·B·穆拉
• 申請（專利權）人: 阿普里拉股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C07H21/00;C12N15/10
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司
• 代理人: 陶家蓉

本發明涉及核酸擴增，例如應用于聚合酶鏈式反應(PCR)的化合物和方法。

檢測是否存在靶核酸在各種領域中起著重要作用，包括：醫學診斷、法醫學和遺傳分析。PCR是核酸擴增方法的例子之一，其提供的高度靈敏方法通過選擇性擴增靶核酸序列來檢測是否存在靶核酸。

核酸擴增，例如PCR的重要問題是會產生非特異性擴增產物。會在PCR反應中造成問題的非特異性擴增過程的例子之一是“引物-二聚體”擴增。例如，當引物的3’末端區域與其自身或另一引物有一定程度互補時，會導致引物-二聚體擴增。這些引物能彼此雜交形成引物-二聚體。然后，引物-二聚體的擴增會產生引物-二聚體擴增子，進而用作進一步擴增的模板。這種過程的后果之一是消耗了引物，從而導致靈敏度降低或者甚至不能擴增所需的靶核酸。

熟知在PCR反應期間加入過量的引物使得甚至3’末端區域的弱互補性亦會產生引物-二聚體擴增子，從而使該問題愈加復雜。因此，需要開發能抑制擴增反應，例如PCR中引物-二聚體形成的試劑和方法。

本文出乎意料地發現在引物的3’末端區域摻入某些修飾的核堿基(nucleobase)對擴增反應期間的引物-二聚體擴增子形成有有益影響。

在一些實施方式中，本發明提供的多核苷酸在離該多核苷酸3’末端不超過4個核苷酸處含有至少一個嘧啶核堿基，其中所述修飾的嘧啶核堿基具有以下結構：

其中R選自-H、-F、-Cl、氰基、硝基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆取代的烷基、C₃-C₁₀芳基、C₃-C₁₀取代的芳基、C₃-C₁₀芳基醚、C₃-C₁₀取代的芳基醚、-CF₃、胺、取代的胺、C₃-C₆環狀烷基、C₃-C₆取代的環狀烷基、苯基、取代的苯基和雜芳基。

在一些實施方式中，R可以是-H。在一些實施方式中，R可以是C₁-C₆烷基。在一些實施方式中，R可以是C₁-C₆取代的烷基。在一些實施方式中，R可以是C₃-C₁₀芳基。在一些實施方式中，R可以是C₃-C₁₀取代的芳基。在一些實施方式中，R可以是-CF₃。在一些實施方式中，R可以是氨基。在一些實施方式中，R可以是取代的氨基。在一些實施方式中，R可以是C₃-C₆環狀烷基。在一些實施方式中，R可以是C₃-C₆取代的環狀烷基。在一些實施方式中，R可以是苯基。在一些實施方式中，R可以是取代的苯基。在一些實施方式中，R可以是雜芳基。在一些實施方式中，R可以是氰基。在一些實施方式中，R可以是硝基。

在一些實施方式中，所述至少一個修飾的嘧啶核堿基離多核苷酸3’末端不超過3個核苷酸。在一些實施方式中，所述至少一個修飾的嘧啶核堿基離多核苷酸3’末端不超過2個核苷酸。在一些實施方式中，所述至少一個修飾的嘧啶核堿基是多核苷酸的3’末端核苷酸。

在一些實施方式中，本發明多核苷酸可以是引物。在一些實施方式中，本發明多核苷酸在3’-末端可延長。

在一些實施方式中，本發明多核苷酸可包含可檢測標記、猝滅劑或小溝結合劑中至少一個。在一些實施方式中，本發明多核苷酸可用作探針。

在一些實施方式中，本發明提供引物延伸的方法，包括將多核苷酸引物與變性DNA模板退火，從而使該多核苷酸引物與該變性DNA模板一條鏈上的互補多核苷酸序列退火以形成引物-模板復合物；和延伸該引物-模板復合物的引物部分以形成雙鏈擴增子，其中所述多核苷酸引物是本發明引物。

在一些實施方式中，本發明提供引物延伸方法，包括在延伸步驟后使雙鏈擴增子變性。在一些實施方式中，可重復退火、延伸和變性步驟至少1次。在一些實施方式中，可重復退火、延伸和變性步驟至少10次。在一些實施方式中，可重復退火、延伸和變性步驟至少20次。在一些實施方式中，可重復退火、延伸和變性步驟至少30次。在一些實施方式中，可重復退火、延伸和變性步驟至少40次。