[發明專利]色譜介質

無效

• 申請號: 200580049255.6
• 申請日: 2005-12-16
• 公開（公告）號: CN101146609A
• 公開（公告）日: 2008-03-19
• 發明（設計）人: 南都·德奧卡;羅伯特·C·巴斯;約瑟夫·M·姆拉多?？?/a>;保羅·A·布伊斯
• 申請（專利權）人: 馬林克羅特貝克公司
• 主分類號: B01J20/22
• 分類號: B01J20/22
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所
• 代理人: 張平元;趙仁臨

發明領域

本發明涉及用于分離和純化各種生物分子如肽類、蛋白質類和抗體類的新的色譜介質、優選混合型聚合物色譜介質的制備和用途。更具體地說，本發明公開了新的色譜介質，優選是混合的陰離子交換劑、混合的陰離子-陽離子交換劑及疏水的交換劑。所述色譜介質通過將聚合物使用聚乙烯亞胺改性和將其官能化而制備。意外地發現，這些混合型聚合物介質提供了增強了的分離能力和蛋白質結合能力。

發明背景

文獻中詳細記載了通過離子交換色譜介質分析蛋白質混合物，例如PeteGagnon，“Purification?Tools?for?Monoclonal?Antibodies”，Validated?Biosystems，Inc.,(1996)。最近，基于蛋白質藥物和疫苗的發展，加大了對更大規模純化蛋白質混合物的需要。非常期望離子交換色譜介質能夠用于該領域。

制備這類色譜介質物質、特別是含伯胺和仲胺官能團的陰離子交換劑的一種方法是使用聚乙烯亞胺(PEI)覆蓋多孔硅物質的內表面。例如，使用聚乙烯亞胺覆蓋二氧化硅顆粒的內表面，接著通過交聯固定，這已經公開于Alpert和Regnier,J.Chromatogr.185,375-392(1979)中，而且以該方式制得的物質在合成寡核苷酸的色譜分離中的應用已經描述在Lawson等人，Anal.Biochem.133，85-93(1983)中。

類似地，由聚乙烯亞氨基丙基-三甲氧基硅烷的共價結合獲得的PEI覆蓋的多孔硅顆粒或可控多孔玻璃顆粒的制品，已經公開于JT?Baker?ChemicalCo.的US?4,540,486中。該專利公開了通過PEI覆蓋的二氧化硅與環狀羧酸酐的反應，形成具有混合的弱堿性/弱酸性官能團的色譜樹脂。已經表明，當這些物質在色譜柱中使用時，可以分離細胞色素C、α1-酸糖蛋白、卵清蛋白和β-乳球蛋白(弱堿性介質)的混合物或者卵清蛋白、細胞色素C、血紅蛋白和溶菌酶(混合的弱堿性/弱酸性介質)的混合物。在免疫球蛋白G的純化中，PEI衍生的多孔硅或其羧化型的效果已經在JT?Baker?Chemical?Co.的US4,606,825中得到證實。

如JT?Baker?Chemical?Co.在US?4,721,573中所述，上述PEI覆蓋的二氧化硅的酰化形式通過引入磺基，可以進一步轉化成混合的弱酸性/強酸性官能介質。使用這種磺酸化介質填充的柱子，可以分離細胞色素C、血紅蛋白、溶菌酶和卵清蛋白的混合物，還可以分離雜交瘤細胞培養基中的蛋白質組分。

通過與單?；然蛑辨滛人狒磻?，PEI共價結合的二氧化硅顆粒還可以轉化成疏水的色譜介質，其中?；梢允侵辨湡N鏈、苯基或取代的苯基。如JT?Baker?Chemical?Co.在US?4,551,245中所述，使用丁酰氯以該方式制得的二氧化硅基質弱堿性/反相色譜介質，可以分離細胞色素C、肌紅蛋白、溶菌酶、卵清蛋白和α-糜蛋白酶原。

在聚乙烯醇(PVA)臂的末端具有離子交換基團的瓊脂糖珠已經在Amersham的WO?98/58732中被公開。然而，與本發明不同的是，PVA間隔臂既不賦予產物任何離子交換能力，其自身也不提供混合型產物中的一種官能性。

二氧化硅基質色譜填料的一個主要缺點是其在高pH下缺乏穩定性。對于涉及純化藥物的應用而言尤其如此，這是因為使用1N氫氧化鈉處理設備是常規的滅菌操作。

發明概述

本發明提供了能夠在高pH下降低或避免上述缺乏穩定性的色譜介質。本發明還提供了混合型色譜介質。已經發現，避免該不穩定性問題的一個可能方法是使用基于在聚合物表面上使用PEI衍生(即非交聯)的聚合物載體的色譜填料，其表面衍生介質可以進一步通過官能化試劑與在聚合物樹脂表面上的聚乙烯亞胺的末端氨基的反應官能化。根據本發明，優選可以提供混合型介質，例如具有混合的伯胺、仲胺和叔胺交換位點的介質、具有弱陰離子和弱陽離子交換位點的介質、具有弱陰離子、弱陽離子和強陽離子交換位點的介質、具有弱陰離子和疏水(反相)交換位點的介質、及具有弱陰離子和強陽離子的介質。此外，意外地發現，基于這種聚乙烯亞胺衍生的聚合且官能化的衍生物的色譜介質提供了不同和獨特的分離特性。在本發明一方面，提供了用于生物分離的聚合物色譜介質。本發明不同于現有的聚合物色譜介質之處在于制備方法和介質特性，這是因為這些現有的色譜介質是簡單的離子交換劑。另外，就制備方法、組成、用途和性能而言，本發明的介質不同于現有的二氧化硅基質介質。出人意料地，根據本發明制得的聚合物混合型介質具有提高了的分離和結合能力。