[發明專利]用于檢測核酸的探針

無效

• 申請號: 200580048571.1
• 申請日: 2005-12-13
• 公開（公告）號: CN101128477A
• 公開（公告）日: 2008-02-20
• 發明（設計）人: J·伯邁斯特;O·塞茨;O·科勒;L·羅格林
• 申請（專利權）人: 拜爾技術服務有限責任公司
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;G01N33/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 溫宏艷;李連濤

技術領域

本發明涉及用于檢測核酸的探針，涉及制備所述探針的方法，涉及用于進行檢測反應的方法，和涉及測試試劑盒，其包含用于進行基于探針的檢測反應所需要的試劑。

背景技術

核酸的檢測具有廣泛的應用領域，例如人類或者獸醫診斷學、食品領域、環境分析、作物保護、生物化學或者藥理學研究和法醫學中。

根據現有技術，核酸或者通過多相測定法或者通過均相測定法進行檢測。多相測定法是需要至少一個洗滌步驟以使探針彼此之間的結合和非結合得到分離的方法。多相測定法如下進行，例如，將探針固定在固體相上，同時在溶液中對核酸進行檢測。通過多相測定法檢測核酸的實例是混雜過濾或者DNA微排列(參見，例如，M.L.M.Anderson，NucleicAcid?Hybridization，Springer-Verlag，New?York，1998或者D.Bowtell，J.Sambrook，DNA?Microarrays，Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press，New?York，2003)。多相測定的優點是其具有同時檢測多種分析物的固有能力(多路復用)，缺點是，例如，需要洗滌步驟。均相測定的特征在于所有組分在溶液中相互反應，其中完全排除了洗滌步驟。在使用比較簡單的裝置時，通常可以選擇利用均相測定的方法，但是其多路復用能力通常有限。無需洗滌步驟有利于自動操作，降低了受污染的風險并且使得檢測反應以劃算的方式進行。

用于檢測DNA的探針通常由雜化和信號單元組成。雜化單元將序列明確連接在DNA靶上，并且由，例如，DNA、PNA或者其它DNA類似物組成。信號單元可以為，例如，放射性標記的微米或者納米顆粒、氧化還原活性分子、發光或者熒光分子。信號單元通常共價連接在雜化單元上。為了防止信號單元干擾雜化，所述雜化單元通常連接在探針的5′或者3′末端的信號單元上。多相測定期間利用洗滌步驟分離連接在欲檢測的核酸上的探針和在溶液中處于游離狀態的探針，均相測定必須保證信號單元在探針的雜化狀態中具有與游離狀態中不同的性能。探針雜化后信號單元的改變可以通過，例如，熒光共振能量傳遞(FRET)或者通過DNA-插入分子得到實現。熒光的實例，根據FRET原理操作的均相探針是TaqMan^探針(PM.Holland等人，Proc.Natl.Acad.USA，1991，88，7276-7280)或者所謂的“分子信標”(WO?95/13399A1；S.Tyagi和F.Kramer，Nature?Biotechnol.1996，14，303-307)。根據FRET原理工作的探針在它們的末端包含熒光基團和猝滅劑，由此熒光可以得到開關，可以說這取決于雜化狀態。在分子信標的情形中，使用的探針是末端連接在熒光基團和猝滅劑上的DNA發夾結構。在沒有雜化至靶體上的狀態中，由于接近猝滅劑，因此熒光作用受到了抑制。在連接靶體的情形中，熒光基團和猝滅劑被空間分離，從而產生了與靶體增加量相關的強度升高的熒光信號。在PCR反應中，為了定量在各個周期中產生的產品的量，可以使用分子信標作為探針。根據現有技術，定量PCR(qPCR)是研究實驗室和診斷學中檢測和定量核酸的一種最常規方法。分子信標的缺點是它們具有限制其敏感性的固有熒光作用，這限制了辨別互補和單基失配靶體之間和可以使用所述探針內的非常狹窄的溫度窗口之間的特異性。連接特異性和敏感性是開發雜化探針中的核心挑戰，它們特別是對于檢測單元突變(SNP)是至關重要的。