[發明專利]通過在非病原性、非侵入性革蘭氏陽性菌中異源表達和分泌復合多糖而有效產生病原性革蘭氏陽性菌莢膜多糖的新方法

無效

• 申請號: 200580048124.6
• 申請日: 2005-12-16
• 公開（公告）號: CN101120013A
• 公開（公告）日: 2008-02-06
• 發明（設計）人: M·N·聶羅普赫羅特;W·M·德福斯;M·克勒爾埃比則姆
• 申請（專利權）人: 食品和營養托浦研究所基金會
• 主分類號: C07K14/31
• 分類號: C07K14/31;C12N15/74;C12N1/21;C12N15/52;A61K39/02;A61K39/09
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司
• 代理人: 林曉紅

技術領域

本發明涉及生物學、特別是微生物學領域，以及細菌細胞中蛋白質 和多糖的異源表達。本發明也涉及醫學領域、特別是感染性疾病的治療 和預防、更特別地涉及疫苗接種領域。

背景技術

微生物多糖(PS)可以與細胞表面共價結合的莢膜多糖(CPS)、脂多糖 (LPS)中的O-抗原的形式存在或者分泌為胞外多糖(EPS)，并且是可引起 侵入性疾病的革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌病原體中的重要的毒力 因子。許多侵入性細菌產生莢膜多糖，莢膜多糖是病原體侵入人體的重 要的毒力因子。莢膜多糖是細胞表面發現的主要抗原，并頻繁地用于制 備疫苗。利用經常與蛋白質載體偶聯和/或與激發免疫反應的佐劑結合的 CPS進行疫苗接種，是一種保護人類抵抗由細菌性病原體(如肺炎鏈球菌 (Streptococcus?pneumoniae)和流感嗜血桿菌b型(Haemophilus influenzae?type?b)(Hib))引起的感染性疾病的有力方法。

足量的安全、純凈和明確的多糖(這樣的多糖不容易通過純化或純 粹的有機合成而獲得)，對于制備安全和具有成本效率的疫苗是重要 的。因此，在非病原性、非侵入性細菌宿主細胞中異源制備莢膜多糖是 純化天然來源的CPS的替代性的、有效的、簡單的、安全的和具有成本 效率的方案。

已經對肺炎鏈球菌(也稱為肺炎球菌)進行了相當多的有關CPS的 研究。肺炎球菌是呼吸道感染、中耳炎和肺炎的常見起因。肺炎球菌 性疾病的最嚴重的形式是肺炎、腦膜炎和敗血癥。肺炎鏈球菌引起疾病 的能力明顯與其多糖莢膜的表達相關，因為所有臨床分離物均被有莢膜 (Whatmore?et?al.，2000)，而自發性無被膜變體是無毒的(Velasco?et?al.， 1995)。當前有至少九十種已知的肺炎鏈球菌的血清學上不同的莢膜類型 (Henrichsen，1999)，各種的不同在于糖苷鍵中的糖組成(參見Weintraub (2003)綜述)。

由于肺炎鏈球菌的抗藥性菌株的播散，肺炎球菌感染的治療已經變 得更加復雜和昂貴。這已經推動了增進我們對莢膜生物合成的調節中涉 及的機制的理解并開發預防肺炎球菌感染的有效疫苗的需要。莢膜多糖 是免疫原性的并用作疫苗抗原。現在，市場上有基于純化的多糖或其糖 綴合物的幾種疫苗(Weintraub，2003)。肺炎鏈球菌的抗原多樣性使有效的 肺炎球菌疫苗的開發復雜化。90多種迄今已知的肺炎球菌性血清型在 其CPS產生和結構上差異很大。并且，莢膜多糖在幼兒中并不能可靠 地引起保護性的和長久的免疫防護。因此，目前的肺炎球菌疫苗聯合來 自幾種血清型的莢膜多糖，包括來自高達20種以上血清型的CPS。這 樣的多血清型疫苗是昂貴的并難以制備。這需要培養許多不同的病原性 的和危險的肺炎鏈球菌血清型、分離并廣泛純化CPS、質量控制菌株和 CPS分離物、以適當的或者需要的數量將其混合，并制成用于接種疫苗 的組合物。

已經描述了通過含有至少一些血清型特異性cps基因的cps基因簇 的DNA片段的同源重組，在另一血清型的肺炎球菌性細胞中制備特定 血清型的肺炎球菌CPS(US?5,948,900)。

人們期望通過如在革蘭氏陰性細菌中生物合成O-抗原多糖所述的相 似路徑來進行大多數肺炎球菌莢膜多糖的制備(Whitfield，1995)。通過糖 基轉移酶在細胞膜的細胞質側的連續作用，將多糖重復單元組裝在脂質 載體上。一旦完成，重復單元通過重復單元轉運蛋白穿過細胞膜轉運， 并聚合在生長的多糖鏈的還原端(Whitfield?and?Roberts，1999)，并共價連 接到細胞壁(Srensen?et?al.，1990)。