[發明專利]從表達腺病毒E1A蛋白的細胞中獲得唾液酸化增加的重組蛋白質的方法及由此獲得的蛋白質

有效

• 申請號: 200580045170.0
• 申請日: 2005-12-28
• 公開（公告）號: CN101090973A
• 公開（公告）日: 2007-12-19
• 發明（設計）人: D·J·E·奧普斯泰爾滕
• 申請（專利權）人: 克魯塞爾荷蘭公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C07K14/505
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司
• 代理人: 林曉紅

發明領域

本發明涉及重組蛋白質生產領域，特別涉及重組蛋白質如紅細胞 生成素的糖基化，更特別涉及當在表達腺病毒E1A的細胞中生產時 重組蛋白質的糖基化。

發明背景

如WO00/63403所示，表達至少腺病毒E1A蛋白的永生化人胚胎 視網膜細胞可適用于生產重組蛋白質。

在表達腺病毒E1A的細胞中產生的具有N聯糖基化的重組蛋白質 具有特異性糖基化模式，例如特征在于存在Lewis-X結構，如WO 03/038100所述。

在表達E1A的細胞中產生的蛋白質的另一特征是呈現相對低的 半乳糖基化及低唾液酸化的N聯聚糖(WO03/038100)。對于某些目的， 這可能是有益的，但對于其它目的，較高水平的半乳糖基化及優選同 時唾液酸化是有益的。

例如，在表達E1A的細胞中產生的紅細胞生成素(EPO)具有顯著 量的Lewis-X結構和在N聯聚糖中相對低百分比的半乳糖基化和唾液 酸化(WO03/038100)，產生非常適于治療缺血/再灌注損傷但不太適合 治療貧血的分子。對于治療貧血，已經確定EPO的高度唾液酸化有益 于增加治療對象血清中EPO的半衰期，由此延長該物質處于活性的時 間而增加紅細胞計數(Goldwasser?et?al.，1974)。

因此，對于治療缺血/再灌注損傷，在表達E1A的細胞中表達EPO 對于為此用途產生的EPO的優選糖基化模式具有潛在益處。然而，對 于EPO的其它應用，不同的糖基化模式可能是有益的。

對于其它蛋白質可存在類似情況，即對于某些應用，基于在表達 E1A的細胞中表達而觀察到的特定糖基化模式可能是高度有益的，而 對于其它目的，不同的糖基化模式也許更適合。

已經對于其它細胞類型描述了在細胞中過表達唾液酸轉移酶以 增加在該細胞中產生的重組蛋白質的唾液酸化(例如Grabenhorst?et?al.， 1995；Minch?et?al，1995；Jenkins?et?al，1998；Zhang?et?al，1998； Weikert?et?al，1999；Fukuta?et?al.，2000；Prati?et?al.，2000)。然而考慮到 糖基化的復雜性及仍未清楚E1A在其中的作用(WO03/038100)，從 前還未知這種方案是否在表達E1A的細胞中產生所期望的結果。特 別地，在表達E1A的細胞中糖基化過程中不同糖基化轉移酶與其它 參與者之間的相互影響和潛在競爭使得尚無法預料及不可預知唾液 酸轉移酶在這種細胞中的過表達對因此產生的蛋白質糖基化模式方 面的結果。

為了拓寬在表達E1A的細胞中產生的重組蛋白質的潛在應用范 圍，增加這種蛋白質的半乳糖基化和唾液酸化是有益的。本發明的一 個目的是提供實現這個目的的方法。本發明進一步涉及提供得自表達 E1A的細胞的新的紅細胞生成素組合物。

本發明的另一目的是提供降低在細胞例如表達腺病毒E1A的細 胞中重組表達的蛋白質上LacdiNAc結構的平均含量的方法。

附圖簡述

圖1.通過對商購EPO(EPREX^TM，泳道A)、在PER.C6-EPO-ST 克隆25-3.10中產生的EPO(泳道B)及在PER.C6-EPO克隆25中產生的 EPO(泳道C)進行等電聚焦確定的唾液酸含量。圖中也示出了每個 EPO分子推定的唾液酸數目。

圖2.在DMEM中，貼壁細胞培養物(A)及在無血清培養基中懸浮 細胞培養物(B)中產生的PER.C6-EPO的去唾液酸化N聯糖的 MALDI-MS譜。

圖3.對在VPRO培養基中無血清懸浮培養物中不過表達唾液酸 轉移酶的PER.C6細胞中產生的EPO(泳道1)、在VPRO中無血清懸浮 培養物中過表達α-2，6-唾液酸轉移酶的PER.C6細胞(即 PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10)中產生的EPO(泳道2)及商購的EPO即 EPREXTM(泳道3)通過等電聚焦確定的唾液酸含量。