[發明專利]嵌段酶－探針復合物

有效

• 申請號: 200580044664.7
• 申請日: 2005-12-26
• 公開（公告）號: CN101088009A
• 公開（公告）日: 2007-12-12
• 發明（設計）人: 青柳克己
• 申請（專利權）人: 株式會社先端生命科學研究所
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司
• 代理人: 韋東

技術領域

本發明涉及用酶標記探針的技術。如此產生的嵌段酶-探針復合物廣泛用于采用免疫反應的免疫檢測，如酶免疫檢測、免疫組化等。?

背景技術

在免疫學檢測或測定方法中通常已廣泛使用用酶標記探針的酶標探針。例如，用辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶等標記的探針可用于免疫組化和酶免疫測定的檢測步驟。?

免疫組化和酶免疫測定已經長期廣泛用作在活體中檢測自身抗原或外來抗原的方法。由于這些采用免疫反應的檢測方法具有高特異性和靈敏度，可無需分離而檢測體內的少量物質。然而，許多物質存在于體內的量非常少，以致于普通的免疫組化和酶免疫測定不能檢測，已進行了一些研究以發現提高檢測方法靈敏度的方法以檢測這些物質。?

例如，健康人血清中腫瘤標記物如癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白的濃度為5-20ng/ml。然而，健康個體血清中人胃泌素釋放肽前體(ProGRP)的濃度約為14pg/ml，需要高1000倍的靈敏度以檢測ProGRP。此外，對于外來抗原，例如丙肝病毒，在血液中的量很小，因此需要高靈敏度的抗原檢測方法。為了檢測該抗原，需要可檢測100-1000個拷貝的病毒RNA和約0.03-0.3pg/ml蛋白質濃度的靈敏度水平。?

為提高免疫檢測方法的靈敏度以檢測以這樣的微量存在于體內的抗原或物質，已經進行了多種努力。Ishikawa等(非專利文獻1)詳細描述了對提高酶免疫檢測靈敏度的研究。影響酶免疫檢測靈敏度的因素包括檢測系統類型、標記的檢測靈敏度、標記方法的類型、免疫反應時間以及抗原和抗體間的親和力。此外，影響用夾心法測定抗原的靈敏度提高的條件包括：抗體與固相連接的條件；抗原反應效率；酶標抗體的反應效率；標記抗體與固相的非特異性吸附的降低；標記抗體的添加量；免疫反應時間；溫度、pH、離子強度和免疫反應緩沖液的選擇；立體化學構型和抗原決定基團的數量。

除了上述研究以外，為了提高酶免疫檢測的靈敏度，人們努力在檢測步驟中在酶和抗體的交聯方面改進標記方法。已知制備標記抗體的各種方法，具體地說，Ishikawa等報道的制備標記抗體的方法已經廣泛應用于普通診斷試劑。在通常所述方法中，一至幾個酶主要結合于抗體(在IgG的情況下，分子量約為150,000，在Fab’的情況下，分子量約為46,000)，例如其中三個辣根過氧化物酶(HRP)(分子量40,000)分子與一個IgG分子結合在一起的復合物的總分子量為40,000×3+150,000＝270,000。同時，其中三個堿性磷酸酶(ALP)分子(分子量100,000)與一個IgG分子結合在一起的復合物的總分子量為100,000×3+150,000＝450,000。然而，Ishikawa等的描述顯示，優選通過以1個分子:1個分子的比例將抗體結合于酶，尤其是采用去除Fc部分后的Fab’部分，實現靈敏度最高的測定，并開發了一種將一個抗體分子共價連接于一個酶分子方法(非專利文件2)。在酶與抗體1:1結合的抗體酶標記法的情況下，例如共價連接的一個HRP分子和1個Fab’分子的復合物的總分子量為40,000+46,000＝86,000。通常，主要采用總分子量為200,000或更小的酶標記復合物。?

為了開發高靈敏度的免疫檢測方法，以各種方式試驗了通過增加步驟以增強信號。例如，采用生物素和抗生物素蛋白的高親和力，主要將幾個生物素分子引入第二抗體，生物素化的第二抗體與待分析物質反應后，去除過量的生物素化第二抗體。然后加入抗生物素蛋白-酶，形成生物素化第二抗體-抗生物素蛋白-酶復合物，并通過增加連接于第二抗體的酶分子數提高靈敏度。可以用抗生物素蛋白-生物素-酶復合物替代抗生物素蛋白-酶。同時，Butler等描述了作為過氧化物酶-抗過氧化物酶抗體的抗體-酶復合物(非專利文獻3)。Bobrow等將過氧化物酶標記的第二抗體與待分析物質進行反應，并在去除過量過氧化物酶標記的第二抗體后，加入生物素-酪胺(tyramide)，使自由基化的生物素-酪胺與過氧化物酶標記的第二抗體周圍的封閉蛋白結合，并在洗滌后用過氧化物酶標記的鏈霉抗生物素蛋白放大酶信號(非專利文獻4)。然而，這些方法都由缺點，如增加步驟數量和測定時間。?