[發明專利]用于實現多階段方法的容器的蓋帽

有效

• 申請號: 200580043231.X
• 申請日: 2005-12-14
• 公開（公告）號: CN101437729A
• 公開（公告）日: 2009-05-20
• 發明（設計）人: 羅納爾德·常
• 申請（專利權）人: 塞弗德公司
• 主分類號: B65D51/04
• 分類號: B65D51/04;B65D43/14;B65D6/28
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 余 朦;方 挺

相關申請的交叉引用

不適用

背景技術

本申請一般涉及用于在封閉條件下分析樣品中一種或多種核酸的存在的系統和方法，具體涉及用于進行該分析的容器的蓋帽，特別是核酸擴增反應，如聚合酶鏈式反應(PCR)。

對于許多研究、醫療和工業應用來說，核酸擴增反應都是至關重要的。這些反應用于臨床和生物學研究、傳染性疾病的檢測和監測、突變的檢測、癌癥標志物的檢測、環境監測、遺傳鑒定、生物防御應用中的病原體檢測等等，如Schweitzer等人的Current?Opinion?inBiotechnology，12：21-27(2001)以及Koch的Nature?Reviews?DrugDiscovery，3：749-761(2004)。特別地，聚合酶鏈式反應(PCR)已經在所有這些領域中應用，包括應用于病毒和細菌檢測、病毒負荷監測、稀有和/或難以培養的病原體的檢測、生物恐怖威脅的快速檢測、癌癥患者中最少量殘留疾病的檢測、食物病原體試驗、血液供給篩選等等，如Mackay的Clin.Microbiol.Infect.，10：190-212(2004)以及Bernard等人的Clinical?Chemistry，48：1178-1185(2002)。關于PCR，如此廣泛應用的主要原因是由于它的速度和容易使用(典型地使用標準化試劑盒和相對簡單且低成本的器具在數小時內進行)、它的靈敏度(經常可以檢測到樣品中幾十個拷貝的靶序列)、以及它的魯棒性(可以容易地分析低質量樣品或保存的樣品，例如法醫樣品或固定的組織樣品)，如Strachan和Read所著的《人類分子遺傳學2》(HumanMolecular?Genetics?2)(John?Wiley?&?Sons，New?York，1999)。

盡管如此廣泛的應用反映出核酸擴增技術中的進步，但依然需要在速度和靈敏度上的進一步提高，特別是在感染性疾病檢測、最少量殘留疾病檢測、生物防御應用等領域中。

通過在兩階段擴增反應中使用嵌套的成套引物已經得到了PCR的靈敏度的顯著提高，例如，Albert等人的J.Clin.Microbiol.，28：1560-1564(1990)。在此方法中，第一擴增反應的擴增子成為用于使用新一套引物的第二擴增反應的樣品，所述新一套引物中的至少一個結合到第一擴增子內部的位置。盡管提高了靈敏度，但是該方法遭受增加的試劑操作和增加的引入污染序列的風險，其能夠導致假陽性。

通過在封閉環境中進行反應也得到了靈敏度的顯著提高和假陽性的減少。高靈敏度擴增技術的缺點是由非靶序列的不當擴增造成的假陽性試驗結果的發生，例如，Borst等人的Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.，23：289-299(2004)。非靶序列的存在可能是由于在反應中缺乏特異性，或者由于來自在前反應的污染(即“攜帶(carry?over)”污染)，或者由于來自直接環境的污染，例如水、一次性器械、試劑等等。可以通過在封閉容器中進行擴增來改善這些問題，使得一旦加入樣品和試劑并將容器密封，就不再發生對反應物或產物的更多操作。“實時”擴增的出現很大程度上使得所述操作成為可能，該“實時”擴增使用連續報告反應混合物中產物含量的標記。

一些方法，如嵌套PCR包括兩個依次進行的步驟。例如，常規的嵌套PCR方法利用兩個依序的擴增步驟，包括：使用外引物擴增延伸靶序列的第一輪反應，以及使用內引物將第一輪反應的產物擴增內部序列的第二輪反應。內部序列能夠或不能與延伸序列的一端交疊。通過對第一和第二擴增步驟的反應條件的嚴格控制，增強了嵌套PCR的靈敏度，從而促成了預期產物的產生。但不幸的是，達到由嵌套PCR方法提供的高靈敏度是以潛在的假陽性為代價的，這是由于包含高濃縮第一擴增子的反應管只能被敞開并操作以實現第二擴增，因此造成了污染的可能，這是導致假陽性的主要原因并降低了分析的可靠性。

發明內容

本發明的各實施例提供了用于容器的蓋帽和用于分析樣品所進行的多階段反應的方法，如兩階段PCR方法，例如嵌套PCR方法或逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。蓋帽便于進行多階段反應，而無需在反應的各階段之間敞開容器或向外界環境暴露其內容，從而顯著降低了污染的風險。