[發明專利]用于鑒定RHO激酶(ROK)調節物的高通量酶聯免疫吸附測定(HT－ELISA)

無效

• 申請號: 200580042758.0
• 申請日: 2005-12-07
• 公開（公告）號: CN101076602A
• 公開（公告）日: 2007-11-21
• 發明（設計）人: M·勒恩;Y·伊瓦先科;E·凱斯勒
• 申請（專利權）人: 塞諾菲－安萬特德國有限公司
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;C07K7/08
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所
• 代理人: 黃革生;林柏楠

技術領域

本發明涉及通過生物素化的肽測量ROK(Rho激酶)蛋白活性 的檢測方法。

發明內容

本發明涉及用于鑒定調節(刺激、減弱、維持)ROK蛋白活性 的化合物的檢測方法，其中

a]提供能夠被ROK蛋白磷酸化的肽；

b]提供ROK蛋白；

c]提供抗體，此抗體能夠識別來自a]的被磷酸化的肽；

d]提供化合物；

e]在能夠使該肽發生磷酸化的條件下，孵育來自a]的肽與來 自b]的ROK蛋白以及來自d]的化合物；

f]按照e]的孵育完成之后，使用來自c]的抗體檢測該肽的磷 酸化；

g]可以將來自f]的結果與另一實驗結果進行比較，所述另一 實驗中對來自a]的肽與來自b]的ROK蛋白而不含d]所給的化合 物進行孵育。

可以以酶聯免疫吸附測定(ELISA)或放射免疫測定(Radio Immun?Assay，RIA)的形式容易地實現這樣的檢測。

至于如前所述測定步驟a]的肽可以由15至25個氨基酸之間 的大小組成。此肽可以包含如下氨基酸序列或由其組成： GGGGAKRRRLSSLRASTS。可以以化學修飾的形式(如生物素化 或連接于DNA或抗體)使用測定步驟a]的該肽。

如前所述測定步驟b]的ROK蛋白可以包含人蛋白質的氨基 酸序列，或者可以從人生物材料衍生或取得。可以通過不同技術 (例如通過對生物材料的操作或包括重組特性的加工步驟)來制備 這樣的ROK蛋白。可以例如將如前面公開的本發明的檢測方法用 于高通量篩選調節ROK蛋白活性的化合物。

本發明還涉及成套藥盒，其包括

a]能夠被ROK蛋白磷酸化的肽；

b]ROK蛋白；

c]能夠識別來自a]的被磷酸化的肽的抗體；

d]可能的第二抗體，其能夠識別來自c]的抗體，和/或連接 于標記系統(如堿性磷酸酶、β-葡糖醛酸酶、過氧化物酶、其它酶)；

e]可能的試劑、緩沖液和/或用于實現來自a]的肽磷酸化的 設備和/或ELISA裝置。

以上提到的成套藥盒的步驟a]的肽由15至25個氨基酸之間 的大小組成。該肽可以包含以下氨基酸序列或由組成： GGGGAKRRRLSSLRASTS。根據測定步驟a]的肽可以以化學修 飾的形式(如生物素化、或連接于DNA或抗體)使用。如前所述測 定步驟b]的ROK蛋白可以包含人蛋白質的氨基酸序列，或者可 以從人生物材料衍生或取得。可以通過不同技術(例如通過生物材 料的操作或包括重組特性的加工步驟)來制備這樣的ROK蛋白。

本發明還涉及如前面提到的成套藥盒的制備方法，其中

a]提供能夠被ROK蛋白磷酸化的肽；

b]提供ROK蛋白；

c]提供抗體，此抗體能夠識別來自a]的被磷酸化的肽；

d]提供可能的第二抗體，其能夠識別來自c]的抗體和/或連 接于標記系統(如堿性磷酸酶、β-葡糖醛酸酶、過氧化物酶、其它 酶)；

e]可能的試劑、緩沖液和/或用于實現來自a]的肽磷酸化的 設備，和/或ELISA裝置。

f]來自a]至e]的組分被相應地包裝并與說明書組合，所述說 明書涉及成套藥盒的其它組分以及ROK蛋白檢測的操作步驟。

如前所述的成套藥盒可以例如用于確定ROK蛋白的活性，或 用于鑒定調節ROK蛋白活性的化合物，或用于高通量篩選。

此發明還涉及肽，所述肽包含如下氨基酸序列或由其組成： GGGGAKRRRLSSLRASTS。可以對這樣的肽進行化學修飾，例 如生物素化。本發明還涉及這樣的肽用于測量ROK蛋白活性的用 途。

本發明的化合物應該意指通過化學合成產生或從天然來源分 離的任何有機化合物和/或碳水化合物。這樣的化合物的分子量可 以在50至50000道爾頓之間。