[發明專利]酶－底物反應的監測

無效

• 申請號: 200580039360.1
• 申請日: 2005-10-21
• 公開（公告）號: CN101061233A
• 公開（公告）日: 2007-10-24
• 發明（設計）人: R·吉爾伯特
• 申請（專利權）人: E2V生物傳感器有限公司
• 主分類號: C12Q1/00
• 分類號: C12Q1/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 胡國群

本發明涉及監測酶-底物反應的方法，鑒別酶活性調節劑或新的酶底物的篩選測定法，和在此類方法和測定法中使用的底物和電化學反應室(electrochemical?reaction?chamber)。

由氧化還原酶催化的反應可以電化學監測。參見，例如Barker?PD，Hill?HA.Prog?Clin?Biol?Res.1988；274：419-33：Directelectrochemical?probes?of?redox?protein?and?redox?enzymestructure?and?function。Allen等人(J.Electroanal.Chem.178(1984)69-86)，和Christensen?and?Hamnett(Techniques?andMechanisms?in?Electrochemistry(1994)356-373)綜述了細胞色素c的電化學。用于測定細胞色素P450活性的電化學系統在WO?00/22158及其中引用的參考文獻中得到描述。然而，由非氧化還原酶催化的反應不能容易地進行電化學監測，因為沒有明顯合適的隨著反應進程改變氧化還原狀態的化學基團。

根據本發明應當理解，如果底物已被氧化還原活性基團標記，那么非氧化還原酶反應可以電化學監測。還應當理解，標記的底物的使用不局限于非氧化還原酶反應。本發明還可應用于氧化還原酶，并且因此提供監測氧化還原酶反應的新方法。

根據本發明，提供了監測酶對底物的修飾的方法，該方法包括：提供已用氧化還原活性基團標記的底物，和修飾該底物的酶；在適合于酶修飾底物的條件下孵育底物和酶；和通過氧化還原活性基團電化學監測酶對底物的修飾。

氧化還原活性基團使得能夠使用標準電化學技術對酶進行動力學研究。例如，使用方法例如本領域技術人員眾所周知的線性掃描伏安法(LSV)或循環伏安法(CV)可以產生伏安波形圖。產生的伏安波形圖可以用于例如測定酶的催化活性、酶反應速率、底物或抑制劑與酶結合的動力學，或進行競爭性抑制研究、測量熱力學反應、篩選酶活性調節劑、或測量藥物交叉反應性。

術語“氧化還原活性基團”在此處用于指可以對底物進行標記，并且能夠在其中酶是催化活性的條件下改變其氧化狀態(即，獲得或失去電子或質子)的任何基團。當施加電位并根據時間的線性函數變化時，當針對施加的電極電壓繪制電流時，對底物標記的氧化還原活性基團的氧化狀態中的改變將產生伏安波形圖。

根據本發明還提供了在本發明方法中使用的已由氧化還原活性基團標記的底物。

底物可以通過將氧化還原活性基團偶聯至底物優選共價地而用氧化還原活性基團進行標記。氧化還原活性基團可以直接，或經由連接體偶聯至底物。當使用連接體時，應當選擇連接體的大小和化學性質，以使連接體對酶修飾底物的任何干擾最小化。

應當選擇氧化還原活性基團，以在其中監測反應進程的條件下給出良好的電化學信號。氧化還原活性基團還應適合將其與底物偶聯所需的化學操作。

氧化還原活性基團是本領域技術人員眾所周知的。合適的基團的例子包括二茂鐵、富勒烯和醌。

底物可以包括或由對應酶的全長天然底物，或僅對應天然底物的一部分的底物組成，條件是使用的底物在適當條件下仍可由酶進行修飾。例如，當酶天然底物是蛋白質或肽時，根據本發明使用的底物可以對應全長的蛋白質或肽，或對應蛋白質或肽的片段。底物可以包括或由重組肽或蛋白質組成。

底物可以由超過一個的氧化還原活性基團標記。氧化還原活性基團可以與底物的任何合適部分偶聯，只要氧化還原活性基團不干擾酶對底物的修飾。當底物是肽或蛋白質時，氧化還原活性基團一般將共價偶聯至肽或蛋白質的氨基和/或羧基末端氨基酸殘基。

在本發明的優選方面，酶是非氧化還原酶。根據本發明的特別優選的方面，酶是激酶或磷酸酶。當酶是激酶時，底物包括在適當條件下通過激酶進行磷酸化的氨基酸殘基。當酶是磷酸酶時，底物包括在適當條件下通過磷酸酶進行脫磷酸的磷酸化氨基酸殘基。

在圖1(a)中圖解顯示了激酶催化的反應。正方形表示底物肽鏈的氨基酸殘基。激酶給特定的氨基酸殘基添加了磷酸(由圓圈表示)，所述氨基酸殘基一般在由激酶特異識別的10-20個氨基酸殘基的基序中。磷酸酶催化逆反應。