[發明專利]濃縮分泌的重組蛋白的方法和組合物

無效

• 申請號: 200580039210.0
• 申請日: 2005-10-03
• 公開（公告）號: CN101061225A
• 公開（公告）日: 2007-10-24
• 發明（設計）人: C·H·塔龍;P·A·科盧西
• 申請（專利權）人: 新英格蘭生物實驗室公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N9/24;C12P21/02
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙蓉民;陸惠中

1.克魯維酵母細胞制備物，特征在于殼多糖酶陰性表型，其中所述表型是編 碼分泌的殼多糖酶的殼多糖酶基因中的突變的結果，所述制備物能夠生長至與野 生型克魯維酵母細胞相似的細胞密度。

2.根據權利要求1的克魯維酵母細胞制備物，還能夠表達和分泌重組蛋白。

3.根據權利要求2的克魯維酵母細胞制備物，其中所述表達由LAC4啟動子 或其修飾物調節。

4.根據權利要求1的克魯維酵母細胞制備物，包括穿梭載體，所述穿梭載體 具有修飾的Lac4啟動子，用于在克魯維酵母中表達蛋白質而在大腸桿菌中不表達 蛋白質。

5.根據權利要求2的克魯維酵母細胞制備物，其中所述穿梭載體是pKLACI。

6.根據權利要求1的克魯維酵母細胞制備物，還包括培養基，在所述培養基 中，所述克魯維酵母至少能夠生長或維持，所述培養基還包括無菌殼多糖。

7.根據權利要求6的克魯維酵母細胞制備物，其中所述無菌殼多糖是磁珠形 式。

8.根據權利要求1的克魯維酵母細胞制備物，其中所述制備物包含在容器中， 所述容器任選地含有磁體或與磁體接觸，用于可逆地結合所述殼多糖珠。

9.得到分泌的重組蛋白質的濃縮制備物的方法，包括：

(a)用含有DNA的載體轉化權利要求1-8任一項所述的克魯維酵母細胞制備 物，所述DNA編碼包括殼多糖結合結構域(CBD)和目標蛋白的融合蛋白；

(b)在所述克魯維酵母細胞中表達所述融合蛋白，并從所述克魯維酵母細胞 分泌所述融合蛋白；和

(c)通過CBD將所述的分泌的融合蛋白結合到殼多糖制備物，以便得到所述 分泌的重組蛋白的濃縮制備物。

10.根據權利要求9的方法，其中步驟(a)中的所述載體是穿梭載體。

11.根據權利要求10的方法，其中在所述載體中編碼所述目標蛋白的所述 DNA在大腸桿菌(E.coli)中轉錄是沉默的，在所述克魯維酵母細胞中轉錄是活化 的。

12.根據權利要求10的方法，其中所述穿梭載體具有修飾的LAC4啟動子。

13.根據權利要求12的方法，其中所述穿梭載體是pKIAC1。

14.根據權利要求11的方法，其中所述克魯維酵母是馬克斯克魯維酵母脆壁 變種(Kluyveromyces?marxianus?variety?fragilis)或乳酸變種(Kluyveromyces?marxianus? variety?lactis)。

15.根據權利要求9的方法，其中所述克魯維酵母細胞處于培養中，因而所 述融合蛋白被分泌到所述培養基中。

16.根據權利要求15的方法，還包括：在培養期間將殼多糖加入所述培養基。

17.根據權利要求16的方法，其中所述殼多糖是無菌的。

18.根據權利要求15的方法，其中所述殼多糖被加入所述培養基。

19.根據權利要求9或17的方法，其中所述殼多糖是選自涂層、膠體、珠、 柱、基質、片層或膜的形式。

20.根據權利要求9或17的方法，其中所述殼多糖是殼多糖珠，所述珠或是 有孔的或是無孔的。

21.根據權利要求20的方法，其中所述殼多糖珠被磁化。

22.根據權利要求21的方法，其中回收與所述殼多糖結合的融合蛋白還包括 施加磁力的步驟(d)。

23.根據權利要求9的方法，其中所述融合蛋白和殼多糖的所述結合是可逆 的，因而在不同于結合條件的非變性條件下，所述融合蛋白可以從所述殼多糖釋 放。

24.權利要求9所述的得到分泌的重組蛋白質的濃縮制備物的方法，其中所 述載體是穿梭載體，其中所述穿梭載體(i)能夠整合到酵母宿主細胞的基因組中， 和(ii)含有DNA，所述DNA編碼含有殼多糖結合結構域和目標蛋白的融合蛋白。