[發明專利]KUNITZ型重組抑制劑

有效

• 申請號: 200580038992.6
• 申請日: 2005-09-15
• 公開（公告）號: CN101142232A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發明（設計）人: 安娜·瑪麗莎·朱德津斯基－塔瓦西;D·A·瑪麗亞;I·d·F·C·巴蒂斯塔;P·L·何
• 申請（專利權）人: 國家聯合化學制藥公司;圣保羅州支援研究基金會;安娜·瑪麗莎·朱德津斯基－塔瓦西
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K14/745
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 李波;黃可峻

本發明涉及獲得對激活的凝血因子X具有抑制活性的重組蛋白的方法，所述重組蛋白表征為Kunitz型抑制劑，獲自卡延鈍眼蜱(Amblyomma?cajennense)的唾液腺的cDNA文庫；涉及獲得該重組蛋白的克隆寡核苷酸序列和氨基酸序列的方法；涉及確定該重組蛋白對激活的因子X的抑制活性的方法；涉及確定血漿中的抗凝活性的方法；涉及確定腫瘤細胞系中的凋亡活性的方法；涉及確定黑素瘤中的抗轉移活性的方法；涉及確定抗癌活性(黑素瘤、結腸癌、乳腺癌、肺癌和白血病)的方法，上述方法是體外和體內進行的。

發明背景

蛋白酶抑制劑是以蛋白水解酶活性的正?？刂茩C理起作用的分子，并且與很多生理過程相關，例如凝血、纖維蛋白溶解、消化，并且也在許多病理中起作用，如癌癥、造血障礙、炎癥和血壓平衡(DECLERCK&IMREM，1994)。

控制凝血的最有效方法之一是蛋白酶抑制劑的作用。研究證明了大多數食血動物物種，如蜱的唾液腺產生一些抗凝物質，其目的是使血液的流動性更強，然后便于其吸食(RIBEIRO，1995)。

激活的因子X(FXa)的抑制劑具有顯著的臨床意義，因為通過Fxa抑制(在凝血酶原酶復合物中)，可以控制凝血酶原激活為凝血酶，從而避免血凝塊形成。

凝血過程一開始，蛋白酶的抑制就立即引發?！敖M織因子途徑抑制劑”(TFPI)是外源途徑的重要抑制劑，分類為BPTI(牛胰蛋白酶抑制劑)型的Kunitz家族抑制劑的成員(Broze，1998)。

人TFPI是一種包含三個Kunitz型結構域(K1、K2和K3)的蛋白，第一個結構域K1在N末端部分具有酸性區域，其中包含了FVIIa的結合位點。在第二個結構域中，存在負責Fxa結合的區域。最后，在第三個結構域的C末端部分存在堿性區域，其功能目前還沒有闡明，但是可能含有肝素結合位點(Rao，1995)。

人TFPI抑制機制包含兩個階段。在第一個階段中，抑制劑自身與因子FXa和FVIIa締合，但抑制實際上將發生在隨后的除段，其中觀察到四價復合物的形成，存在組織因子(TF)、FXa、FVIIa和人TFPI(TFPI：FXa：FVIIa：TF)(Sandset&Bendz，1997)。

2型人組織因子抑制劑“組織因子途徑抑制劑-2”(TFPI-2)是一種由三個Kunitz型結構域組成的32-kDa的蛋白(Chand?et.al.，2004)。TFPI-2抑制多種參與凝血和纖維蛋白溶解的絲氨酸蛋白酶，這可能由于第一個Kunitz型結構域的24位的精氨酸殘基(R24)。在第二和第三個結構域中，分別存在谷氨酰胺和絲氨酸殘基。在最近的研究中，制備了突變體，其中的精氨酸殘基被谷氨酰胺殘基修飾(R24Q?TFPI-2)，并且該突變引起了對牛胰蛋白酶的抑制活性損失大約90％。這一事實證明了該殘基在保持抑制活性中的重要性(Kamei?et.al.，1999)。

癌癥發展及其與凝血的相互作用的一般方面

通過一些遺傳和環境因素的組合，確定受試者發生腫瘤的風險。因此，在癌癥發生過程中，稱作致癌物(其具有生物、化學或物理性質)的物質可以作為發展到形成轉移的過程的起始物或甚至促進劑(Ruoslahti?E.，1996)。

在腫瘤過程的起始中，DNA的靶結構發生不可逆改變，導致細胞轉化。致癌物代謝示于兩個階段，稱作階段I(激活)和階段II(解毒)。一些階段I的酶不僅僅是氧化反應的催化劑，也代謝大量的致癌物或親脂性異生素(Bell?et.al，1993)。

DNA破壞的持續性依賴于修復機制，并且依賴于破壞的組織的細胞壽命持續，這樣，如果破壞持續或不修復，突變的細胞克隆會擴充(Duke?et?al，1996；Wainscoat?e?Fey，1990)。

在起始的細胞發生一個過程，很多時候該過程很長，其減少潛伏期和/或增加它們對遺傳改變的易感性。通常促進劑不是基因毒性的。它們是組織特異性，并且具有以外遺傳形成起作用的多種作用機制，導致組織平衡的擾亂(Hermo?et?al，1987)。

促進機制包括細胞表面受體的激活、胞質溶膠酶的激活或抑制、轉錄和翻譯因子的激活(通過激酶)、增殖刺激、凋亡抑制和直接細胞毒性。

在進展階段，腫瘤細胞也顯示出形成新血管的能力，所述血管將供應腫瘤，促進不受控制的增加，因為它們首先侵入圍繞它們的組織，并且可以到達淋巴管或血管內部，通過它們播散到其它器官中。(Meyeret.al.，1998，Matsuda?et?al?2003)。