[發(fā)明專利]用于親和分離的微泡

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200580038082.8
• 申請(qǐng)日: 2005-11-03
• 公開（公告）號(hào): CN101065497A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: T·亞當(dāng)斯;E·雅布隆斯基
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 盧卡迪亞技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/70;G01N33/53;G01N33/543;G01N33/552;G01N33/544;G01N33/547;G01N33/546;G01N33/537;G01N33/531;G01N33/20
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 徐迅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于親和分離、親和純化和親和分析的基于親和分子包衣微泡的 方法、組合物及試劑盒。

背景技術(shù)

細(xì)胞、病毒、細(xì)菌和水溶性分子的分離領(lǐng)域已使用了各種微粒作為固相來 吸附或結(jié)合所關(guān)注的目標(biāo)物質(zhì)。例如，配體(如抗體)包衣的磁性微粒可以結(jié)合 到靶細(xì)胞或水溶性蛋白質(zhì)上。目標(biāo)物質(zhì)通過結(jié)合到磁性微粒上，實(shí)現(xiàn)了其與他 類細(xì)胞或蛋白質(zhì)的分離。目前對(duì)該原創(chuàng)性工作已有各種改進(jìn)，且多年前就出現(xiàn) 有商業(yè)化產(chǎn)品。

其他研究者曾經(jīng)使用過橡膠顆粒、脂質(zhì)體、乳脂球和塑料顆粒(如聚苯乙烯、 聚乙烯、聚丙烯、尼龍等)。作為捕獲載體，這些物質(zhì)都具有其各自的特性和問 題。對(duì)非目標(biāo)細(xì)胞或蛋白質(zhì)的非特異性吸附是這些方法中最常見的問題，從而 導(dǎo)致分離不良。此外，大多數(shù)方法在結(jié)合步驟以后都需要至少一個(gè)附加步驟以 實(shí)現(xiàn)未結(jié)合樣品和微粒結(jié)合物之間的分離，如磁性微粒需要施加磁場(chǎng)；有時(shí)需 要通過離心或過濾將微粒從溶液中分離。

微粒結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞或蛋白質(zhì)所需的時(shí)間通常與其表面積和單位體積溶液 中的微粒數(shù)相關(guān)。顆粒越小，表面積越大，從而結(jié)合越快。然而，大的表面積 通常會(huì)增加非特異性結(jié)合。

分離方法可能會(huì)根據(jù)其本身的性質(zhì)或原理共同分離不同的微粒。這在基于 重力離心法(gravity?centrifugation)的分離中尤為明顯，在此過程中微粒、細(xì)胞或 其它物質(zhì)可能會(huì)共同形成丸狀(co-pellet)。此外，某些細(xì)胞類型如巨噬細(xì)胞和單 核細(xì)胞，它們本身可以非特異性吞噬這些微粒，從而和目標(biāo)細(xì)胞一起被分離。 盡管通過一定的步驟或預(yù)防措施可以將以往技術(shù)中的個(gè)別問題最小化或避免， 但某些局限性是內(nèi)在的且是不可能徹底克服的。目前不同的方法獲得了不同程 度的成功，這表明需要尋找一個(gè)更好的解決該問題的辦法。

最理想的分離制劑應(yīng)該具有無窮大的表面積而完全沒有非特異性相互作 用，從而保證結(jié)合過程可以快速進(jìn)行，并將其與非目標(biāo)細(xì)胞或水溶性分子的結(jié) 合降至最低。理想的分離劑應(yīng)當(dāng)在不捕獲非目標(biāo)細(xì)胞或分子的前提下達(dá)到其和 細(xì)胞懸液或可溶性分子溶液間的分離。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了用于親和分離或親和分析的組合物，其包括親和分子共價(jià)包衣 的微泡。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述微泡為蛋白質(zhì)微泡，如白蛋白微泡。通過 向蛋白質(zhì)溶液中引入氣體，如采用超聲處理，可以制得蛋白質(zhì)微泡。作為本發(fā)明的 一個(gè)方面，通過包括加熱蛋白質(zhì)溶液的方法可以向其中引入氣體。在另一實(shí)施方式 中，通過蛋白質(zhì)變性或以Cr⁺⁺⁺處理，可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)微泡。

本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述微泡為玻璃微泡。作為本發(fā)明的一個(gè)方面， 所述玻璃微泡的密度約為0.6g/cc，平均直徑為30μm左右。

本發(fā)明中的親和分子可以是受體、配體或抗體。或者，該親和分子也可以是 生物素、抗生物素蛋白或鏈親和素。

可通過例如使用異雙功能試劑，如4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基 琥珀酰亞胺酯，將親和分子直接連接到微泡上。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，親和 分子通過例如和至少另一個(gè)分子相互作用，間接連接到微泡上。作為本發(fā)明的一方 面，微泡直接連接到鏈親和素上，而親和分子是生物素化的，通過鏈親和素和生物 素的相互作用將親和分子連接到微泡上。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，親和分子可以通過微泡上的環(huán)氧包衣連接到 微泡上。在另一實(shí)施方式中，親和分子通過微泡上的胺基官能團(tuán)連接到微泡上。

作為本發(fā)明的一方面，玻璃微泡經(jīng)處理產(chǎn)生具有反應(yīng)活性的表面殘基，該 殘基和3-氨丙基三乙氧基硅烷反應(yīng)，產(chǎn)生胺。另一方面，玻璃微泡具有順式- 二醇包衣，通過該順式-二醇(cis-diol)包衣，親和分子可以直接連接到玻璃上。 可例如如下產(chǎn)生順式-二醇包衣：處理玻璃微泡以產(chǎn)生具有反應(yīng)活性的表面羥基 殘基，使該殘基與3-環(huán)氧丙氧基三甲氧基硅烷反應(yīng)產(chǎn)生環(huán)氧官能團(tuán)，用酸處理 該環(huán)氧官能團(tuán)，使該環(huán)氧官能團(tuán)轉(zhuǎn)化為順式-二醇官能團(tuán)。

本發(fā)明也提供了一種產(chǎn)生用于親和分離或親和分析的蛋白質(zhì)微泡的方法。 一方面，該方法包括加熱蛋白質(zhì)溶液。在該方法的另一方面，通過超聲處理蛋 白質(zhì)溶液，向其中引入氣體，從而制得蛋白質(zhì)微泡。在該方法的另一方面，在 一種氣體或混合氣體的存在下對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行機(jī)械處理。

作為本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述氣體為空氣，所述蛋白質(zhì)為白蛋白。通過 例如Cr⁺⁺⁺處理可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)微泡。