[發明專利]以細胞內線粒體為指標的心肌細胞的選擇方法

有效

• 申請號: 200580029000.3
• 申請日: 2005-08-26
• 公開（公告）號: CN101056973A
• 公開（公告）日: 2007-10-17
• 發明（設計）人: 服部文幸;福田惠一
• 申請（專利權）人: 阿斯比奧制藥株式會社;學校法人慶應義塾
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;G01N33/48;C12Q1/06
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 陳昕

技術領域

本發明涉及完整心臟構成細胞群、或來自干細胞細胞群的心肌細胞的選擇方法、和利用該方法的方法。

背景技術

在成熟個體中的心肌細胞喪失了增殖活性，重癥性心肌梗塞、心肌癥等的疾病必需依賴心臟移植。不過，目前，為了克服心臟捐獻不足的問題，找到心臟移植以外的治療方法成為了當務之急。與此相對，認為在體外制備心肌細胞，用以補充心肌細胞，是救濟必需依賴心臟移植的患者的最有希望的方法。

作為心肌細胞的制備方法，正在對使胚胎干細胞分化而使用的方法、以及選取暗示了生物內存在的干細胞(體干細胞)、誘導分化的方法等進行了研究。不過，作為干細胞的性質，由于存在心肌細胞以外的細胞作為副產物而產生的問題、和使未分化的細胞殘存的性質的問題，所以至今尚不能將進行了分化、誘導的細胞集團直接用于治療。所以，為了在人中能夠實際應用，必需從進行了分化、誘導的細胞集團中選出心肌細胞。

目前，作為純化心肌細胞的方法，尚沒有有關向干細胞的基因組中導入某些標記基因的方法以外的有效方法的報道(FASEB?J.2000；14：2540-2548)。不過，改變基因組由于不僅本身存在倫理上的問題，而且伴隨著細胞癌化率的變化等無法預測的重大風險，所以為了在人體實際應用還存在著很大的問題。

已知心臟中氧氣消耗量與主要的組織相比較高而且心臟中線粒體的含量比較多(Am?J?Physiol?1985；248：R415-421)。此外，心肌細胞一旦細胞分化·成熟，分裂能顯著消失也是廣為人知的。不過，應用上述這樣的心肌細胞的性質而對心肌細胞進行選擇的嘗試在以往的技術領域中完全未知。此外，還沒有著眼于線粒體的膜電位，將心肌細胞線粒體的膜電位和其他細胞線粒體的膜電位直接進行比較研究的例子，以線粒體的膜電位作為指標進行心肌細胞的選擇研究的例子也尚無報道。

非專利文獻1：FASEB?J.2000；14：2540-2548

非專利文獻2：Am?J?Physiol?1985；248：R415-421

發明內容

發明所要解決的問題

本發明人等以開發下述內容作為課題：使用與以往直接地選出心肌細胞無關的心肌細胞的多種性質，從完整心臟構成細胞混合物和來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物中，不伴隨基因的改變地選出心肌細胞的方法。

用于解決問題的方法

本發明人等根據心肌細胞與其他全部細胞相比較，相對的線粒體含量多的性質以及心肌細胞線粒體與其他全部的細胞線粒體相比較其膜電位高的性質，成功地解決了上述課題，建立了使用線粒體特異性標記試劑，標記含有心肌細胞的細胞混合物，通過測定細胞的相對的線粒體含量以及/或者線粒體膜電位，不伴隨心肌細胞的基因的改變，選擇心肌細胞的開創性方法。

具體而言，在本發明的第一種實施方式中，提供了從含有心肌細胞的細胞混合物中，根據細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位，不伴隨心肌細胞的基因改變地選出心肌細胞的方法。

即、在本發明的方法的第一種實施方式提供了：

含有心肌細胞的細胞混合物中，根據細胞的相對的線粒體含量，不伴隨心肌細胞的基因改變地選出心肌細胞的方法；

從含有心肌細胞的細胞混合物中，根據細胞的相對的線粒體膜電位，不伴隨心肌細胞的基因改變地選出心肌細胞的方法；或者

從含有心肌細胞的細胞混合物中，根據細胞的相對的線粒體含量以及膜電位，不伴隨心肌細胞的基因改變地選出心肌細胞的方法。

本發明的方法的該實施方式，其特征在于，使用線粒體指示劑，標記含有心肌細胞的細胞混合物，對細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位進行測定。

此處，含有心肌細胞的細胞混合物，其特征在于，是完整心臟(或稱為“總心臟”)構成細胞混合物或者來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物。

此外，可能分化成肌細胞的細胞，其特征在于，是選自干細胞、前體細胞以及卵細胞構成的組。

本發明的該具體實施方式中，使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物后，在測定細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位之前，也可以還包括在無線粒體指示劑的存在下培養標記的細胞的步驟。