[發明專利]蛋白質生產方法

無效

• 申請號: 200580011512.7
• 申請日: 2005-02-11
• 公開（公告）號: CN101123972A
• 公開（公告）日: 2008-02-13
• 發明（設計）人: H·多賴
• 申請（專利權）人: 森托科爾公司
• 主分類號: A61K31/70
• 分類號: A61K31/70
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 劉玥

發明領域

本發明涉及改變蛋白質細胞分泌速率的方法。

發明背景

蛋白質例如抗體的大規模生產通常依賴于蛋白質自培養的生產細胞系的分泌?？扇菀椎淖灾車毎囵B基回收及純化培養細胞產生的分泌性蛋白質。

蛋白質的細胞表達速率是影響自生物反應器或其他體系生產和純化分泌性蛋白質的一個重要參數。通常，如果細胞表達比較高則可獲得更高純度的蛋白質產量。相反，如果細胞表達速率過低則蛋白質可能不適于純化。

一種防止低表達細胞難題的方法已經被用于自低表達細胞群體分離高表達、亞克隆細胞。通常，需要有限的系列稀釋、高表達細胞系篩查和選擇的數個費時、費力的循環?；蛘?，制備產目的蛋白的全新的細胞系并希望產生的新細胞系為高表達細胞系。

上述每個制備高表達細胞系的方法均有局限性。例如，高表達細胞在群體中相對稀少以及鑒別任何高表達細胞均需要大量時間和勞力限制了從大量低表達細胞中通過亞克隆鑒別高表達細胞系。

進一步的，新細胞系不是高表達的可能性以及再生產生抗體的細胞和鑒別高表達細胞將需要非常大量的勞力限制了產生抗體或感興趣蛋白質的新細胞系的制備。在一些實例中，盡管努力獲得高表達細胞系但僅可得到低表達細胞系。

因此需要改變蛋白質的細胞分泌速率的有效方法。

附圖簡述

圖1顯示相對于Sp2/0親代骨髓瘤細胞系在高表達細胞系中提高了的SLPI基因轉錄水平。

圖2顯示相對于Sp2/0親代骨髓瘤細胞系在高表達細胞系中提高了的CD53基因轉錄水平。

圖3顯示相對于Sp2/0親代骨髓瘤細胞系在高表達細胞系中增加了的轉鐵蛋白-1生成。

圖4顯示相對于C463a親代骨髓瘤細胞系在高表達細胞系中提高了的SLPI基因轉錄水平。

圖5顯示在C463a衍生亞克隆中抗體產生增加時SLPI基因轉錄水平逐漸增加的趨勢。

圖6顯示相對于C463a親代骨髓瘤細胞系在高表達細胞系中增加了的轉鐵蛋白-1基因轉錄水平。

圖7顯示在C463a衍生亞克隆中抗體產生增加時轉鐵蛋白-1基因轉錄水平逐漸增加的趨勢。

發明概述

本發明的一個方面是一種改變蛋白質細胞分泌速率的方法，包括調節至少一種選自細胞中分泌性白細胞蛋白酶抑制劑(SLPI)、CD53或轉鐵蛋白-1的分子的活性及培養細胞的步驟。

本發明的另一個方面是一種帶有改變細胞分泌速率的骨髓瘤細胞，通過調節至少一種選自細胞中分泌性白細胞蛋白酶抑制劑(SLPI)、CD53或轉鐵蛋白-1的分子的活性及培養細胞的步驟生成。

發明詳述

說明書中引用的包括但不限于專利和專利申請書的所有公開通過引用其全部內容結合到本文中。

文中所用“抗體”指其寬廣的含義且包括免疫球蛋白或抗體分子，包括多克隆抗體，單克隆抗體，包括鼠類、人、人源化及嵌合單克隆抗體及抗體片段或變異體?？贵w為構成性表達的分泌性蛋白質且通過漿細胞分泌。也可使用無限增殖化漿細胞通過標準方法例如雜交瘤增殖或通過將抗體重鏈或輕鏈基因轉染入無限增殖化B細胞例如骨髓瘤細胞或其他細胞類型例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、植物細胞及昆蟲細胞產生抗體。

抗體片段或變異體包括模擬抗體(mimetibodie)、Fab片段、F(ab′)₂片段、Fc片段、重鏈片段、輕鏈片段和含有至少一種抗體肽鏈的一部分的分子。這些部分可與抗體可變區、鉸鏈區或恒定區肽鏈相對應。

文中所用術語″模擬抗體″指具有通式(I)的蛋白質：

(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)

(I)

其中V1至少為免疫球蛋白可變區N-末端的一部分，Pep為至少一種結合到表位的活性肽，Flex為使模擬抗體具有選擇定向及結合特性提供結構柔性的多肽，V2至少為免疫球蛋白可變區C-末端的一部分，pHinge至少為免疫球蛋白鉸鏈區的一部分，CH2至少為免疫球蛋白CH2恒定區的一部分且CH3至少為免疫球蛋白CH3恒定區的一部分，其中n和m可為1-10間的整數。模擬抗體可依靠構建體中存在的重鏈恒定區氨基酸序列摹擬不同類型免疫球蛋白分子例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD及IgE的性質和功能。