[發明專利]一種篩選自身抗原的方法

有效

• 申請號: 200810089581.5
• 申請日: 2008-04-08
• 公開（公告）號: CN101556278A
• 公開（公告）日: 2009-10-14
• 發明（設計）人: 趙曉航;高紅軍;喬媛媛
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院腫瘤研究所;中國人民解放軍海軍總醫院
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N27/64
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 羅菊華

技術領域

本發明涉及細胞生物學和蛋白質領域，具體而言涉及一種快速篩選自身抗原的方 法。本發明的方法可以在幾個月內從細胞提取的蛋白中有效地篩選出自身抗原，而適合為 自身免疫病、腫瘤等各種能夠產生自身抗體的疾病的藥物制備提供有用的靶標。

背景技術

生物、物理、化學以及藥物等因素作用于機體時，可以使自身抗原發生改變、免疫 隔離部位抗原釋放、分子模擬效應產生、表位擴展以及免疫忽視被打破，這些改變可以引起 自身免疫病。二十世紀七十年代發現腫瘤患者體內可以檢測到自身抗體和(或)自身反應性 T淋巴細胞，證實了腫瘤抗原(自身抗原的一種)的存在^[1]。目前認為腫瘤抗原產生的分子機 制主要包括細胞癌變過程中合成了新的蛋白分子，基因突變或重排使正常蛋白分子結構發 生改變，糖基化等原因導致異常的細胞蛋白特殊的降解產物，隱蔽抗原表位的暴露，胚胎抗 原或分化抗原的異常表達等。

自身抗原的鑒定對研究自身免疫病，腫瘤疾病的發病機理，機體的免疫功能與疾 病發生發展和轉歸的相互關系至關重要；是發展有效的疫苗，診斷試劑，治療性抗體，篩選 有效藥物靶點的必要前提。因此自身抗原鑒定的新方法不斷出現，根據研究目的不同大致 可以分為兩大類^[2]，一是以探索新型抗原或抗體為目的方法；二是以評價被報道過的抗原 或重要功能蛋白為目的方法。第一類抗原鑒定的方法應用比較多的主要有兩種，基于cDNA 表達文庫篩選的血清學分析方法(serologicalanalysisofrecombinantcDNA expressionlibraries，SEREX)和基于二維凝膠電泳(two-dimensionalelectrophoresis， 2-DE)、Western-blot的血清學蛋白質組分析方法(Serologicalproteomeanalysis， SERPA)。第二大類方法包括常規免疫檢測方法和應用肽序列標簽研究抗原的方法，前者包 括酶聯免疫吸附測定(enzyme-labeledimmunosorbentassay，ELISA)和蛋白芯片法。

第一大類方法立足于發現新型的自身抗原。cDNA表達文庫篩選的血清學分析方法 是目前文獻報道比較多的方法，該方法的主要優點是通量高，應用多個抗原特異的血清在 一次實驗中可以檢測多個腫瘤相關抗原。用SEREX方法雖然已經鑒定多種腫瘤相關的抗 原^[3-9]，但該技術的主要缺點比較明顯^[6]：1.免疫篩選的原核表達系統不能對外源表達蛋白 進行糖基化修飾，不能保證重組蛋白的正確折疊，因此體液免疫反應不能檢測相應抗原的 特定表位甚至所有表位；2.cDNA文庫的建立對高表達水平的抗原有偏好，而相應的低豐度 抗原可能被漏掉；3抗原鑒定需要的時間相當長，工作量很大。SERPA技術是2000年出現的鑒 定自身抗原的一種方法，該方法以2-DE和Western-blot為基礎，聯合蛋白質譜鑒定策略篩 選自身抗原^[10]。與SEREX方法比較，該方法主要的優點是整個實驗耗時較短，避免了構建 cDNA文庫和預雜交消除非特異性結合的步驟，可以保持蛋白的轉錄后修飾，更好地提供抗 原決定簇。

SERPA技術用于自身抗原的篩選研究雖然已有眾多報道^[10-21]，但其主要的不足是 2-DE本身的一些缺陷如分離極酸、極堿蛋白和水溶性差的膜蛋白能力有限，檢測靈敏度的 限制只能鑒定豐度相對較高的抗原，另外2-DE是勞動密集型實驗，檢測的血清越多工作量 越大。同時，所需患者或對照血清量較大。第二大類方法是對現有的抗原進行評價，而不是 探索新型自身抗原的方法。