[其他]鹿茸組織細胞培養方法

在審

• 申請號: 101986000007913
• 申請日: 1986-11-20
• 公開（公告）號: CN1003177B
• 公開（公告）日: 1989-02-01
• 發明（設計）人: 高云;吳玉林;王斌;李春義;程利平;趙世珍
• 申請（專利權）人: 高云
• 代理公司: 北京萬科園知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 張亞軍

一種鹿茸組織細胞的培養方法，選擇未分化的間充質或者前成軟骨細胞，經過細胞分散處理，接入培養液中，在３６～３８℃條件下，培養成試管型鹿茸細胞。該鹿茸細胞具有良好的分裂增殖能力、強烈的生命力和繁延能力，其試管型鹿茸細胞相當于鹿茸“臘片”組織細胞，其藥用價值超過一般鹿茸。該培養方法的試驗成功，為人工大批生產鹿茸組織細胞提供了現實可能。

本發明屬于鹿茸組織細胞培養方法。

直到提出本發明為止，與本發明相近的研究是Morrism Bubenik G.A.對激素與生茸關系的研究[CA：100：45542C（1984）]。該研究只是在鹿體上探明了雄激素對茸骨成熟和骨化作用，并未涉及鹿茸組織細胞在離體條件下的培養方法。

本發明的目的是將鹿茸組織細胞移植于培養瓶中，在離體條件下，賦予人工生長環境，建立完善的鹿茸組織細胞培養技術，使鹿茸組織細胞繁延于培養瓶中，獲得試管型鹿茸細胞。

本發明的特征在于所采用的培養液配方為（1）1%MEM液69-96%、雙抗1%、小牛清3-30%、PH6.8-7.3。（2）1%MEM液69-96%，雙抗1%、鹿血清3-30%，PH值6.8-7.3;選擇未分化的間充質或者前成軟骨細胞，經過細胞分散處理，接入培養液（1）或（2）中，細碎粒與培養液比例為1∶50（g/ml），鹿茸細胞懸液與培養液比例為1∶25（ml/ml），置于培養瓶，在36-38℃條件下，培養14-21天，成為試管型鹿茸細胞。

經細胞培養得到的液體，含有大量鹿茸細胞，該種鹿茸細胞具有良好的分裂增殖能力，稱為人工離體培養鹿茸的試管型前成軟骨細胞。這種試管型前成軟骨細胞，經若干次分裂后，可圓縮分化為其性質相當于鹿茸“臘片”部位組織的試管型前成軟骨細胞。因此，其藥用價值超過一般鹿茸。此外，本發明無論對采自鹿體的二杠茸、初角茸、去勢茸和畸形茸，均能培養出試管型鹿茸細胞，而且用該技術培養的試管型鹿茸細胞存在著異常強烈的生命力和繁延能力，超過其它哺乳動物的任何組織細胞。

下面按操作過程詳細敘述本發明的培養方法：

1、材料選取：選擇1-5歲的健康鹿鋸茸，在實驗室內進行清洗、消毒，用無菌器開口，剝下茸皮，采取增生帶組織未分化的間充質或者前成軟骨細胞。

2、細胞分散處理：細胞分散處理有兩種方法。一種是細胞細碎粒的制備，將采取的鹿茸增生帶組織細胞用兩把尖刃刀，在滴有血清的玻片上，對刃分割鹿茸組織，直到不能分割的細碎粒為止。另一種是細胞懸液的制備，將采取的鹿茸增生帶組織細胞切成小塊，放入搗碎機內，加入1%MEM液，（MEM液從美國購進，系Flow Laboratories Inc的產品，產品序號10-121-24）。其鹿茸組織塊與1%MEM液比例為1∶3（g/ml），開機3-5分鐘，停幾分鐘后，再開機，經數次搗細成細胞懸液。

3、培養液的制備：本發明所用的培養液有兩種，可任選一種。培養液1的配方比為：1%MEM液74%、雙抗1%（雙抗為青霉素和連霉素。其配制方法，請參考《細胞生物學實驗指導》高等學校教學參考書，汪德耀主編，人民教育出版社出版·1981年12月第1版第188頁），小牛血清25%，PH值為7.0-7.2。培養液2的配方比為：1%MEM液74%、雙抗1%、鹿血清25%，PH值為7.0-7.2。

4、試管型鹿茸細胞的培養。將經過分散處理的增生帶組織細胞接入培養液中，其比例為：細胞細碎粒與培養液1∶50（g/ml）;鹿茸細胞懸液與培養液1∶25（ml/ml）;裝于培養瓶中，蓋好瓶塞，輕輕搖動，放在37℃條件下，培養成試管型鹿茸細胞。

5、細胞傳代：試管型鹿茸細胞在培養液中生長14-21天后，進行細胞傳代培養，細胞傳代時，先傾出原培養液，用無鈣、鎂去離子液（FCE）洗數次，加ATV消化（ATV購自美國SIGMA化學公司，產品序號87F-05525），再加培養液1或培養液2進行分瓶培養。