[發明專利]通過陽離子交換層析純化藥物活性蛋白的方法

無效

• 申請號: 02140217.5
• 申請日: 2002-06-28
• 公開（公告）號: CN1396176A
• 公開（公告）日: 2003-02-12
• 發明（設計）人: L·斯卡珀爾;G·C·維斯克米
• 申請（專利權）人: 阿爾法·瓦瑟曼公司
• 主分類號: C07K1/18
• 分類號: C07K1/18;C07K14/555;C07K14/765
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 李華英

發明背景

大部分生物醫學科學本身基于使用通過提取技術獲得的天然來源的藥物活性蛋白和通過來自重組DNA的技術獲得的合成來源的藥物活性蛋白。有意義產物的純度水平在這兩種情況中均是重要的，因為可以通過在有固定量蛋白質存在的情況下嚴格結合生物作用的可能性來確定對其活性的了解。

在上下文中，藥物活性蛋白的純化方法占重要部分，因為當涉及藥物制品中包含的活性成分或賦形劑時，所制備的蛋白質的純度具有重要意義。在治療過程中導致毒性作用和/或產生不良作用的可能性實際上促使負責基于蛋白質的藥品的銷售的注冊與授權的管理機構引入從未有過的更為嚴格的法規以便確保在銷售藥品中包含的蛋白質來源的活性成分的質量和生產一致性。

從上述描述中顯然可以看出蛋白質純化方法的重要性，其中存在的主要困難在于藥物活性蛋白始終與許多其它蛋白質一起存在于復合的混合物中。

這一事實在天然來源用于從動物或植物器官中提取類似于血液這樣的藥物活性蛋白和使用重組DNA技術這兩種情況中均是存在的，因為所述的蛋白質表現出與它們來源無關的兩者之間相似的化學-物理特性。

因此，從上述描述中可以得出：就純化藥物活性蛋白而言，必須從混有具相似特性且通常大量超過所需蛋白量的其它蛋白質中分離出具有高純度的蛋白質。

工作方向是明確的且通常使用幾個純化步驟以便獲得所需的純度水平。在這種方式中純化方法變得極為復雜且成功進行蛋白質的工業化生產主要要與純化方法的效率結合，因為后者充分決定著生產成本。

許多技術用于純化蛋白質，例如：在含水和有機溶劑中或使用caotropic?agents的選擇性沉淀；通過過濾和/或透析的分離；使用適宜抗體的免疫沉淀法；層析法。在這些方法中，后者在近年來已經取得了更大的進展，主要是因為這些方法可以獲得所需的純度，正如Regnier?F.E.在J.Chromatogr.418，115-143(1987)中所報導的。

科學文獻中引用了許多技術且可以基于用于分離蛋白質的作用機理對其進行分類，例如：基于分子量的分離；在極性基質、也稱作常態固定相上的吸附；在非極性基質、也稱作反固定相上的吸附；通過使用與惰性基質，諸如銅、鋅、鐵和鉑這樣的重金屬，類似于亮藍這樣的化學染料，類似于蛋白質A和蛋白質G這樣的蛋白質，類似于多糖和葡糖胺聚糖這樣的碳水化合物結合的配體進行的選擇性親和吸附；使用結合在惰性基質上的特異性抗體進行的免疫親和吸附；使用結合在惰性基質上的帶靜電荷的配體進行的離子相互作用的吸附。

將選擇性、即選擇性識別所需蛋白質的能力、成本和在工業化水平上使用的可能性用作評價不同層析技術性能的參數。

基于這些參數，將免疫親和層析看作可確保有更大的選擇性，不過，它表現出類似于使用成本高、存在使抗體變性的風險和與純化產物最終安全性相關的風險這樣的缺點，這是因為所述的抗體來源于動物。

將使用離子相互作用、也稱作離子交換層析的層析法看作用于保持蛋白質藥物活性且易于以使用低成本控制的工業化方式進行的幾乎沒有風險性的技術，不過，這項技術表現出選擇性較差的缺點。

因此，極為有利的是找到實施離子交換層析的條件，這些條件可增加其選擇性以便從獲得產物的純度的觀點來看使它與其它技術相差無幾。

通常使用各種大小的柱進行離子交換層析，這些柱上填充了含有持久或在特定條件下帶靜電荷的化學基團的固體基質。

上離子交換柱的化合物通過庫侖引力/斥力與結合基質的電荷發生相互作用。混合物中含有的不同化合物自身能夠與起所帶電荷量的作用的固定相結合且結果是它們或多或少被保留，從而確保它們在柱口分離。

當基質的電荷是負性時，所述的層析法稱作陽離子交換層析，因為陽離子被吸附，而當基質的電荷是正性時，所述的層析法稱作陰離子交換層析。

蛋白質是具有高于10,000道爾頓的高分子量的由氨基酸的非均相聚合物構成的化合物；某些氨基酸在其側鏈上帶有可以在帶負電的酸性氨基酸或帶正電的堿性氨基酸溶液的pH作用下離子化的官能基且由此所有的蛋白質均帶有大量的負電荷和正電荷。蛋白質的等電點pI是蛋白質呈中性時的pH，因為提供的負電荷等于提供的正電荷；進入pI下的電場的蛋白質不被電場中任意的極性端所吸引。

負電荷的數量在高于pI的pH下增加且蛋白質獲得了凈負電荷，而相反的情況在低于pI的pH下發生且蛋白質獲得了凈正電荷。每種蛋白質均具有其自身的特征pI，它可使該蛋白質與其它蛋白質區別開來且某些蛋白質在等電點下傾向于變得不溶。