[發明專利]基因表達量比較分析法

無效

• 申請號: 02138093.7
• 申請日: 2002-08-09
• 公開（公告）號: CN1398988A
• 公開（公告）日: 2003-02-26
• 發明（設計）人: 周國華
• 申請（專利權）人: 周國華;中國人民解放軍南京軍區聯勤部軍事醫學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司
• 代理人: 夏平

1、一種基因表達量比較分析法，其特征在于它具有如下特征：

(a)將不同來源的信使核糖核酸(mRNA)用適當的方法標記后，等量混合，作為聚合酶鏈反應(PCR)的底物；

(b)用與基因各來源相對應的引物和基因特異性引物進行PCR擴增；

(c)用生物發光分析法測定序列，以堿基種類代表基因的不同來源，信號強度代表各來源中基因表達量。

2、根據權利要求項1所述的基因表達量比較分析法，其特征在于所述“不同來源的mRNA”是指同一基因在同一生物種的不同個體或同一基因在同一個體的不同器官，如健康人和病人某一器官中的mRNA；也可指同種個體中的同一基因在不同的化學或物理刺激下產生的表達。

3、根據權利要求項1所述的基因表達量比較分析法，其特征在于所述“與各來源相對應的特異性引物”是指一組序列不同，但由相同種類和數目的堿基所組成的引物，每一種引物代表一種基因的來源。

4、根據權利要求項1所述的基因表達量比較分析法，其特征在于所述“用適當的方法標記”是指用適當長度的DNA片段來區別各來源基因的方法，第一種方法：將不同來源的mRNA用反轉錄PCR(RT-PCR)法制成雙鏈互補DNA(cDNA)后，用限制性內切酶將之切成適當長度的片段，用選擇性適配器(adapter)與之相連接，不同來源的mRNA連有不同的adapter；第二種方法：將帶有多聚胸腺嘧啶引物的微球分別與不同來源的mRNA雜交，并制成第一鏈cDNA，用5’端含有與各來源相對應序列的錨定引物進行互補鏈(第二鏈cDNA)的合成，錨定引物的5’端用于區別基因的不同來源；第三種方法：直接用5’端含有與各來源相對應序列的錨定引物與mRNA雜交，并制成第一鏈cDNA，錨定引物5’端的構造與第二種方法相同。

5、根據權利要求項4所述的基因表達量比較分析法，其特征在于所述“選擇性適配器”是指含有與權項4中限制性內切酶切口互補的序列，并在連接酶作用下能與切口完全連接的楔形雙鏈DNA，其中一條鏈的5’端含有權項3中與各來源相對應的特異性序列，另一條鏈的3’端含有與上述鏈不互補的堿基，或3’端經過適當修飾不能在DNA聚合酶的作用下發生延伸反應。兩條鏈組成“Y”型的結構，一端不互補，成叉型分開，另一端成權項4第一種方法中限制性酶切口的形狀。

6、根據權利要求項4所述的基因表達量比較分析法，其特征在于所述“選擇性適配器”和“錨定引物”中用于區別基因不同來源的部分是指一段堿基種類和數目相同而排列順序不同的序列，它們具有相同的熔解溫度(Tm值)。

7、根據權利要求項1所述的基因表達量比較分析法，其特征在于所述“生物發光分析法”是指定量測定延伸反應產生的焦磷酸鹽(PPi)的方法。

8、根據權利要求項7所述的基因表達量比較分析法，其特征在于所述“延伸反應”是指在權項1中的PCR擴增產物的單鏈產物中，加入特定的引物或引物混合物進行退火，然后按一定次序分別逐個加入三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)，或三磷酸雙脫氧核苷酸(ddNTP)，或它們的類似物，在DNA聚合酶的作用下，當所加dNTP或ddNTP或它們的類似物與模板互補時，所發生的聚合反應。

9、根據權利要求項8所述的基因表達量比較分析法，其特征在于所述“單鏈產物”是指用物理或化學的方法將權項1中的PCR產物制成的單鏈產物，其中“物理學方法”指用生物素(biotin)標記PCR中的一種引物，然后用固相法制備單鏈，“化學方法”是指用酶切法制備單鏈。

10、根據權利要求項7所述的基因表達量比較分析法，其特征在于所述“延伸反應”指權項1中的PCR擴增產物，經酶處理去除PCR反應中的PPi，過剩的dNTPs和過剩的引物后，加入單鏈結合蛋白(如SSB)，其余按項8進行反應。