[發明專利]楊樹轉抗蟲基因技術

無效

• 申請號: 02132854.4
• 申請日: 2002-09-03
• 公開（公告）號: CN1398511A
• 公開（公告）日: 2003-02-26
• 發明（設計）人: 王寶全
• 申請（專利權）人: 遼寧生生生物技術股份有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 鞍山大千專利事務所
• 代理人: 聶振峽

1、一種楊樹轉抗蟲基因技術，其特征在于：是以楊樹優良品種歐美楊107(Populus×euramericana?cl.“74/76”)為試材，采用楊樹轉抗蟲基因技術進行了組培再生、農桿菌介導的抗蟲基因轉化及轉基因植株的抗蟲性研究，建立了高效的外植體再生體系、進行了遺傳轉化條件的研究，確定了葉片及莖段外植體對潮霉素抗性的臨界濃度、獲得了轉基因再生植株，組培快繁了大量轉基因楊樹苗；

試驗選用的材料為：

(1)、菌種和質粒：含Bt基因的植物表達載pCUBVgb轉化的根癌農桿菌LBA4404；

(2)、植物材料：歐美楊107(Populus×euramericana?cl.

“74/76”)；

(3)、供試昆蟲：榆毒蛾(Leucoma?candida?Staudinder)幼蟲和

天幕毛蟲幼蟲；

(4)、主要化學試劑：Km(卡那霉素)、Cb(羧芐青霉素)、Hyg(潮霉素)、Rif(利福霉素)；PCR擴增引物、Taq酶、dNTP、buffecr、λDNA：

(5)、培養基：(1)、農桿菌培養基(YEB)蛋白胨(Peptone)5g/L；蔗糖(Sucrose)1g/L；牛肉膏(Beet?Extract)5g/L；酵母提取物((Yeast?Extract)5g/L；MgSO₄·7H₂O0.5g/L；固體則加入1.4％瓊脂，以1mol/LNaOH調pH值為7.2；(2)、植物組織培養基以MS為基本培養基，附加不同濃度激素，配置各種培養基：

繼代培養基：MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg7mg/L；

共培養培養基：莖段：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L；

??????????????葉片：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L；

篩選分化培養基：莖段：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L+Hyg7mg/L+250mg/LCb；

葉片：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg?5mg/L+250mg/LCb；

生根培養基：MS+0.02mg/LIBA+Hyg5mg/L+Cb250mg/L；

各培養基均含3％蔗糖和0.7％瓊脂，PH值為5.8，抗生素抽濾滅菌，其它成分高壓滅菌；

2、根據權利要求1所述的楊樹轉抗蟲基因技術，其特征在于：楊樹轉抗蟲基因技術方法為：

(1)、潮霉素臨界濃度的確定：

設計6個潮霉素的濃度梯度：0(CK)、3、5、7、10、15mg/L，在楊樹不定芽分化培養基中加入上述濃度的潮霉素，取生長健壯的無菌苗葉片及莖段，切成0.5cm大小，置于培養基中，一個月后觀察分化情況確定葉片及莖段對潮霉素的抗性濃度；

(2)、菌液的準備：

①、菌種的活化

從甘油管中挑取含有植物植物表達載體的農桿菌菌液劃線于YEB平板上，(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)置于28℃恒溫箱中，過夜培養形成單菌落；

②、菌液的培養

從平板上挑取農桿菌單菌落，接種于10mlYEB液體培養基(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)中，28℃180～200rpm震蕩培養過夜，次日早晨取過夜培養的菌液0.8～1ml加至20ml新鮮的不含抗生素的YEB液體培養基中，繼續震蕩培養3～5h，至菌液濃度OD₆₀₀＝0.3～0.5時，8000rpm離心5min，沉淀用MS液懸浮，并稀釋20～30倍即可用于轉化：

(3)、葉盤法轉化楊樹：

利用葉盤法(Horsch，1985)對楊樹進行抗蟲基因轉化，取生長健壯的無菌苗葉片和莖段，切成0.5～1cm大小，投入到用MS液懸浮稀釋的菌液中，室溫下不斷搖動使外植體與菌液充分接觸10min，取出后用無菌濾紙吸去表面多于的菌液，放入鋪有一層濾紙的共培養培養基中，25℃下暗培養2～3d，然后轉入選擇分化培養基中培養；

(4)、菌液濃度及侵染時間對轉化效果的影響：

①、菌液濃度的影響

取楊樹無菌苗的莖段作為外植體，分別在OD₆₀₀值為0.1、0.3、0.5、0.8的農桿菌菌液中侵染10min，觀察不同的菌液濃度對轉化效果的影響；

②、侵染時間的影響

取楊樹無菌苗的莖段作為外植體，分別在OD₆₀₀值為0.3、0.5、的農桿菌菌液中侵染10、20、30、40min，觀察不同侵染時間對轉化效果的影響；

(5)、轉化植株的獲得：

經過農桿菌侵染的葉片及莖段外植體在芽選擇分化培養基上，在溫度為25～28℃，光/暗周期為16/8h的條件下培養兩周后，逐漸有抗性芽產生，將抗性芽同外植體一起繼續進行選擇培養，當抗性芽長至2cm左右時，轉移至生根培養基上誘導生根；

(6)、轉化植株的鑒定：

①、潮霉素抗性鑒定

取轉化植株的葉片和非轉化對照植株的葉片，切成0.5～1cm大小，放置含有Hyg5mg/L的分化培養基上，觀察其分化狀況；

將轉化芽與非轉化芽分別接種于含有Hyg7mg/L的繼代培養基中觀察其生長情況；

②、轉基因植株的PCR檢測

質粒DNA的提取：挑取農桿菌單菌落接種于5mlYEB液體培養基中(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rit50ug/ml)，28℃震蕩培養過夜，將菌液倒入1.5mlEppendorf管中，8000rpm離心3min，收集菌體；倒掉上清液，沉淀中加入10ul溶液1(50mM葡萄糖、25mMTris-Hcl，PH8.0，10mMEDTA-Na₂，PH8.0)，以牙簽懸浮菌體，冰浴5～10min；加入200ul溶液2(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，輕輕顛倒混勻，冰浴10～15min；10000rpm離心5min，上清用等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)反復抽提2～3次；水相轉入新管，加入兩倍體積的無水乙醇，混勻后于-20℃放置30min，10000rpm離心8min，沉淀吹干后溶于適量TE緩沖液中；

植物總DNA的提取：取適量新鮮的植物葉片，置于研缽中加液氮迅速研磨成粉末，將研碎的樣品轉入無菌離心管中，立即加入400ulSDS提取緩沖液(100mM?NaCL，50mMEDTA，0.5％SDS，50mMTris，PH7.4)輕輕混勻粉末，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)顛倒混勻，10000rpm離心4min，重復抽提2～3次，直至中間蛋白質層看不見為止；吸取上層水相，加入2倍體積的無水乙醇，充分混勻，-20℃放置30min，有DNA沉淀產生；1000rpm離心5min沉淀DNA，去盡上清液，沉淀吹干后溶于適量TE緩沖液中；

總DNA的PCR擴增：以轉化植株中提取的植物總DNA為模板，用PCR儀檢測轉基因植物中外源基因的整合情況；

擴增引物為：5′端引物5′-GGTAATGGTAACGCCATGCTCCTT?3′

????????????3′端引物5′-CCAGTTACTGCAACACTCGAGGCT?3′

PCR反應系統：在0.5ml滅菌離心管中加入

10×PCRbuffer????????????????????2ul

4×dNTP(2mM)?????????????????????2ul

Primer1(10pmol/ul)???????????????2ul

Primer2(10pmol/ul)???????????????2ul

Taq酶(1u/ul)?????????????????????1ul

模板DNA(約25ng)??????????????????2ul

D₂H₂O?????????????????????????9ul

總體積???????????????????????????20ul

上封10ul石蠟油，按以下條件進行35個循環

94℃(denaturing)?????????????????1min

60℃(annealing)??????????????????30S

72℃(exteuding)??????????????????1.5min

反應結束后，取反應混合物在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳檢測結果；同時以未經轉化的107楊DNA的PCR產物為陰性對照，：

(7)、轉基因植株抗蟲活性測定：

將30頭一齡幼蟲放入瓶口封閉的玻璃瓶中，在20℃±2℃的人工氣候箱中飼養，每隔兩天換葉片一次，同時檢查昆蟲的死亡數并鑒別蟲齡；

將存活的幼蟲稱重、計算幼蟲死亡率、校正死亡率、幼蟲平均體重；采用下列公式計算：

(8)、轉基因植株苗其生長與形態觀察：

選擇抗蟲性強、中等、無顯著抗蟲性的轉基因系號，以及未轉基因(CK)等的嫩枝扦插小苗高20cm，栽植在苗圃試驗地上，每個系號40株、生長120天高生長停止后，逐株測定苗高；各系號選出最大值的5株，求其平均值和標準差進行檢驗，同時觀察生長正常的一年生和兩年生苗木的干形、分角、葉片形態。