[發明專利]一種4－香豆酸：輔酶A連接酶基因及其克隆

無效

• 申請號: 02132631.2
• 申請日: 2002-07-19
• 公開（公告）號: CN1390940A
• 公開（公告）日: 2003-01-15
• 發明（設計）人: 安利佳;劉文哲;蘇喬;高曉蓉;楊君
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/63;C07H21/04
• 代理公司: 大連理工大學專利中心
• 代理人: 侯明遠

技術領域

本發明是一種4-香豆酸：輔酶A連接酶基因及其克隆，屬于生物工程領域，特別涉及到紫穗槐(Amorpha?fruticosa)編碼4-香豆酸：輔酶A連接酶的基因及其克隆。

背景技術

林業生產中樹木的價值不但在于木材產量，還體現在木纖維的理化指標上。木纖維主要由木質素和纖維素組成。纖維素是主要由β-D-葡萄糖基以1-4糖苷鍵連接而成的復雜的高分子物質，是造紙的主要原料。造紙制漿的過程就是要從植物纖維原料中去除木質素類物質，盡量保留纖維素和半纖維素。木材與禾桿植物細胞壁中木質素含量相當高，這就是常用造紙原料在制漿造紙工業中產生污染的根本原因。為了降低污染，人們開展了多學科的廣泛研究。隨著植物分子生物學的飛速發展，人們開始重視從造紙原料——植物入手，試圖在了解植物生長發育機理及分子調控的基礎上，通過基因工程途徑研究開發出立足減輕環境污染、更適合于制漿造紙工業的植物資源，從根本上解決造紙污染問題。因此涉及植物纖維素合成以及降低植物木質素含量或改變其組成的基因工程的研究、應用對紙漿工業具有非常重要的作用。本發明試圖從降低植物木質素含量這個角度來研究如何改善樹木材質的問題，并通過基因克隆及其在轉基因植物中的表達來研究相關基因在植物體內的作用。此項研究的成功必將從根本上大大減輕乃至消除因降解木質素而對環境產生的污染，提高造紙制漿行業的生產率，保護生態環境。因此，通過基因工程技術控制木質素含量和組成，可在農林業生產中得到應用。

4-香豆酸：輔酶A連接酶(4-Coumarate：CoA?ligases，4CL，EC?6.2.1.12)的主要功能是催化羥基苯乙酸到相應的硫酯的反應，維持苯丙酸類(如木質素和黃酮類化合物)生物合成所需新陳代謝功能，可利用香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸作為底物，催化合成木質素單體，調節木質素合成。4CL反義基因，可抑制4-香豆酸：CoA連接酶在轉基因植物中的表達，降低木質素含量。從降低植物木質素含量這個角度來研究如何改善樹木材質的問題，可從根本上大大減輕乃至消除因降解木質素而對環境產生的污染，提高造紙制漿行業的生產率，保護生態環境。

發明內容

本發明的目的是提供一種紫穗槐(Amorpha?fruticosa)編碼4-香豆酸：輔酶A連接酶的基因4CL序列及其相應的氨基酸序列。提供了含有4CL的克隆載體pUC19/4CL和含有這種載體的E.coli細胞JM109/pUC19/4CL。利用本發明成果，可以構建4-香豆酸：輔酶A連接酶基因工程菌，用于植物的基因轉化，達到改善植物品質的目的。

本發明采用的技術方案是利用簡并寡核苷酸PCR法結合cDNA末端快速擴增PCR法，以紫穗槐莖RNA為模板，先用簡并PCR引物，通過RT-PCR的方法，得到了4CL基因片段，又據此片段設計反向嵌套引物，用RACE方法獲得了未知的5’和3’端基因片段，從而克隆了紫穗槐4CL全長cDNA，并測定了核苷酸序列。將4CL和克隆載體pUC19分別用限制性內切酶切割，形成互補的粘性末端，T4DNA連接酶連接，形成4CL克隆載體pUC19/4CL。熱激法將這個克隆載體導入感受態E.coli細胞JM109，成為含有pUC19/4CL的大腸桿菌細胞JM109/pUC19/4CL。