[發明專利]寄生型假絲酵母、熱帶假絲酵母和白隱球酵母檢測鑒定方法

無效

• 申請號: 02123445.0
• 申請日: 2002-06-28
• 公開（公告）號: CN1396266A
• 公開（公告）日: 2003-02-12
• 發明（設計）人: 王建華
• 申請（專利權）人: 王建華;中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12N1/16
• 代理公司: 北京路浩專利代理有限公司
• 代理人: 錢寶英

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，具體地說是一種寄生型假絲酵母、熱帶假絲酵母和白隱球酵母快速檢測鑒定方法。

技術背景：

寄生性假絲酵母和熱帶假絲酵母同屬于半知菌類假絲酵母屬，寄生性假絲酵母是人類重要病原菌，熱帶假絲酵母也是重要機會性病原菌，這兩種酵母菌在普通和發酵飲食品和飼料中檢出率很高(Déak，T.and?Beauchat，1996；Samson?R.A.，etal.，1992；Alvaro?F.，Gloria?S.，and?Jack?W.F.，2000)，白隱球酵母菌Cryptococcusalbidus和白假絲酵母菌Candida?albidus都是(尤其是女性)皮膚組織感染的重要真菌類病原菌，由此兩種病原菌引起的疾病臨床診斷名稱分別為白隱球酵母病Cryptococcosis和白假絲酵母病Candidiasis。顯而易見，此三種酵母的快速檢測、鑒定方法具有重要理論和實用意義。由于酵母菌傳統分類以及本身的復雜性和多樣性，對于發酵飲食品和飼料中寄生性假絲酵母和熱帶假絲酵母的準確檢測往往需要花費大量時間。盡管目前已經可以應用基因擴增等先進方法對物種進行準確鑒定，但由于(1)酵母種類的多樣性和復雜性，(2)基因擴增要求的病原菌的最低生物量(靈敏度)各不相同，(3)種間特異性引物設計的難度，(4)種內特異性PCR擴增產物序列確認的難度，使得該方法應用于快速鑒定、檢測尚有一定距離。至少在目前還沒有能夠應用于一般生產和應用領域的PCR快速鑒定與檢測方法。至于其他鑒定方法如化學分類、數值分類等等均需要做多次繼代、精細化學分析難以達到一般生產和應用領域的快速要求。1975年Chaskes和Tyndall首先發現了重要病原菌Cryptococcus?neoformans具有利用芳香性化合物(DOPA)通過體內代謝產生并分泌特異性有色產物(黑色素)的特性，和具有快速檢測意義的特異性鑒定培養基。在過去幾十年，不斷有報道指出一些酵母能夠利用芳香類化合物作為碳源通過體內代謝產生和分泌有色產物(Cain，1980；Middelhoven，1993；Chaskesand?Phillips，1973；Chaskes和Tyndall，1975；1978；Carreira?et?al.，1998)，但真正運用這一原理作為一種分類指標加以研究和應用只是近幾年的事情，1998年里斯本理工大學Virgilio?B.Loureiro小組(Carreira?and?Loureiro，1998)利用這一原理建立了快速鑒定培養基，他們發現重要病原菌Cryptococcus能夠特異性地利用氨基酚和二氨基苯產生和分泌有色產物，并首次建立了另外一種重要病原菌Yarrowialipolytica的快速鑒定培養基，發現：該種酵母能夠以酪氨酸作為唯一碳源通過代謝產生褐色產物，而且這一特性具有種的特異性，通過優化培養基成分和培養條件，可以使這種特異性鑒定培養時間控制在24小時之內。此外，對于另外一種重要的病原菌Candida?albicans，以特異性酶聯免役反應為基礎已經建立起有效的快速鑒定方法，并且已經應用于臨床診斷(Hoppe?J.E.and?Frey?P.，1999；Campbell?C.K.etal.，1998)，顯然，特異性生色培養基和特異性酶聯免役反應是目前簡單有效的病原菌快速檢測鑒定手段，相比而言，特異性生色培養基比特異性酶聯免疫反應具更廉價的商業優勢。但是關于寄生型假絲酵母Candida?parapsilosis和熱帶假絲酵母Candida?tropicalis，目前尚無特異性生色鑒定培養基。

發明內容：

本發明提供一種專門用于寄生型假絲酵母、熱帶假絲酵母和白隱球酵母菌的特異性生色鑒定培養基，有效檢測時間15-20小時。本發明檢測培養基具備如下幾個要素：一是待測菌株能夠生長，二是產生特異性反應，三是反應指標明顯易測，四是培養基中具有滿足第二和第三條件的特殊成分。

一種用于檢測鑒定寄生型假絲酵母、熱帶假絲酵母和白隱球酵母培養基，它除含有普通培養基所需的碳水化合物、生物素、維生素、瓊脂，還含有對-氨基苯甲酸、螯合劑、生色反應促進劑以及三種堿性氨基酸天冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸。

本發明所述的培養基，其碳水化合物可以是葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖之一，適宜濃度范圍是0.01％到1.00％。其中葡萄糖、果糖和蔗糖是適宜碳源，優選葡萄糖。葡萄糖和果糖優選0.05％。

本發明所述的培養基中對-氨基苯甲酸的濃度范圍是0.1％--1.0％，優選0.8％。