[發明專利]治療乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制備工藝

無效

• 申請號: 02114435.4
• 申請日: 2002-02-05
• 公開（公告）號: CN1364898A
• 公開（公告）日: 2002-08-21
• 發明（設計）人: 劉軍;薛采芳
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/11;C12N15/63;C12N15/70;C12Q1/68;A61K38/46
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司
• 代理人: 徐文權

1、一種治療乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制備工藝，其特征在于：

1)hEDN編碼基因的擴增及測序

1.1根據hEDN基因序列進行引物設計

正向引物：5′-GCG?CGG?ATC?CAC?CAT?GAA?ACC?TCC?ACA?GTT?TAC-3′；

反向引物：5′-GCG?CGA?GCT?CGA?TGA?TTC?TAT?CCA?GGT?G-3′；

正向引物及反向引物的5′端分別帶有BamH?I和Sac?I酶切位點；

1.2擴增目的基因

在5×10⁶～10×10⁶的HL-60細胞中加入1ml的Trizol^，反復吹打，在15℃～30℃下放置5分鐘，然后加入0.2ml的氯仿，劇烈震動15秒，在15℃～30℃下放置2-3分鐘后在2℃--8℃、12000g的相對離心力下離心15分鐘，吸取上層水相；

在上層水相中加入0.5ml的異丙醇，在15℃～30℃下放置10分鐘后在2℃～8℃、12000g的相對離心力下離心10分鐘，去上清，得到HL-60細胞的總RNA；

應用One?Step?RNA?PCR?kit試劑盒，在每個PCR聚合酶鏈式反應管中加入5μl的10×One?Step?RNA?PCR?Buffer、10μl濃度為25mmol/L的MgCl₂、5μl濃度為10mmol/L的dNTP、1μl的RNase?Inhibitor、1μl的AMV?ReverseTranscriptase?XL、1μl的AMV-optimized?Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的無RNA酶的純水混合后，分別置于50℃下30min反應一次、94℃下2min反應一次，然后再置于94℃下30s、55-65℃下30s、72℃延伸1-10min分別循環25-40次；

2)HBVc編碼基因的擴增及測序

2.1根據HBVc編碼基因的基因序列進行引物設計

正向引物：5′-GCG?CGA?GCT?CAT?GGA?CAT?CGA?CCC?TTA?T-3′；

反向引物：5′-GCG?CAA?GCT?TTT?AAC?ATT?GAG?GTT?CCC?GAG?A-3′；

正向引物及反向引物的5′端分別帶有Sac?I和Hind?III酶切位點；

2.2擴增目的基因

向2.2.15細胞加入1ml/10cm²的Trizol^，在15℃～30℃下放置5分鐘后，加入0.2ml/1ml?Trizol^的氯仿，劇烈震動15秒，再在15-30℃下放置2-3分鐘后，在2℃～8℃、12000g的相對離心力下離心15分鐘，吸取上層水相；

在上層水相中加入0.5ml/1ml?Trizol^的異丙醇，15-30℃下放置10分鐘，2℃～8℃、12000g的相對離心力下離心10分鐘，去上清，得到2.2.15細胞的總RNA；

應用One?Step?RNA?PCR?kit試劑盒，在每個PCR聚合酶鏈式反應管中加入5μl的10×One?Step?RNA?PCR?Buffer、10μl濃度為25mmol/L的MgCl₂、5μl濃度為10mmol/L的dNTP、1μl的RNase?Inhibitor、1μl的AMV?ReverseTranscriptase?XL、1μl的AMV-optimized?Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的無RNA酶的純水混合后，置于50℃下30min、94℃下2min反應一次，然后再置于94℃下30s、55-65℃下30s、72℃延伸1-10min分別循環25-40次，得到PCR產物；

2.3克隆與測序

將hEDN和HBVc的產物PCR經1.0-1.5％瓊脂糖凝膠電泳后用NucleoTrap^Nucleic?Acid?Purification?Kit試劑盒，進行純化回收；

將回收產物分別用BamH?I和Sac?I、Sac?I和Hind?III酶切后純化回收，分別與用BamH?I和Sac?I及Sac?I和Hind?III酶切后純化回收的pUC18連接；連接產物轉化大腸桿菌JM109株，以High?Pure?Plasmid?Isolation?Kit試劑盒，提取質粒，再用BamH?I和SacI及Sac?I和Hind?III酶切鑒定；

序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動序列測定儀進行；

2.4靶向核糖核酸酶真核表達載體構建

將擴增的hEDN及HBVc編碼基因分別用BamH?I和Sac?I、Sac?I和Hind?III雙酶切，將真核表達載體經BamH?I和Hind?III雙酶切后，以T4連接酶連接hEDN、HBVc、pcDNA3.1(-)酶切片段，轉化E.coli?JM109感受態細胞；

用含Amp的固體培養基(LB)篩選陽性克隆，經小量提取質粒，并酶切鑒定后，構建融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc；

2.5帶有柔性的(Gly₄Ser)₃連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體構建

2.5.1柔性連接區編碼基因的合成首先合成兩條互補的寡核苷酸鏈，序列如下：

P1?5’gcgcggatcc?ggt?ggc?ggt?ggc?tcg?ggc?ggt?ggt?ggg?tcg?ggt?ggcggc?gga?tct?gagctc?gcgc3’

P2?5’gcgcgagctc?aga?tcc?gcc?gcc?acc?cga?ccc?acc?acc?gcc?cga?gccacc?gcc?acc?ggatcc?gcgc3’

將上述兩條寡核苷酸鏈以無菌雙蒸水稀釋至濃度為40μmmol/L，各取15μL混勻后，分別置于94℃下5分鐘使兩條寡核苷酸鏈變性，再分別置于80℃下5分鐘、75℃下5分鐘、70℃下5分鐘、65℃下5分鐘、60℃下5分鐘、55℃下10分鐘使兩條寡核苷酸鏈復性；

將復性后的產物經1.5-2％瓊脂糖凝膠電泳后純化回收，即為柔性連接區編碼基因；

2.5.2帶有柔性的(Gly₄Ser)₃連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體構建

將融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc經Bam?I和Sac?I雙酶切后形成的大片斷命名為p/HBV；

將純化回收的p/HBV與經BamH?I和Sac?I雙酶切的經變性、復性后的兩條寡核苷酸鏈柔性連接區編碼基因以T4連接酶連接，形成重組質粒p/LHBV；

將p/LHBV以BamH?I酶切，Klenow補平，Hind?III酶切后，純化回收小片斷LHBV；

融合真核表達載體pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc經Sac?I酶切，T4?DNA多聚酶削平，Hind?III酶切后，純化回收大片斷p/hEDN；

將LHBV和p/hEDN以T4連接酶連接，轉化E.coli?JM109感受態細胞；用含Amp的固體培養基(LB)篩選陽性克隆，經小量提取質粒，并酶切鑒定后，構建帶有柔性的(Gly₄Ser)₃連接區的靶向核糖核酸酶真核表達載體p/LTR。