[發明專利]促人參皂甙生物合成相關基因

無效

• 申請號: 02114062.6
• 申請日: 2002-04-19
• 公開（公告）號: CN1377886A
• 公開（公告）日: 2002-11-06
• 發明（設計）人: 羅志勇;陸秋恒;胡維新;陳湘暉;羅建清;劉水平
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅醫學院
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04;C12N15/11;C12N15/29;C12P19/34
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所
• 代理人: 趙洪

技術領域

本發明涉及改良植物性狀的基因工程，具體是促人參皂甙生物合成相關基因。

背景技術

藥用植物中的人參(Panax?ginseng?C.A.Meyer)為五加科，系我國特產的具有世界影響的傳統名貴中藥材，在我國及東南亞地區有數千年的用藥歷史，是藥用植物中極具典型性和代表性的人參屬植物。人參皂甙為其主要藥用有效成分，由人參二醇和人參三醇型皂甙組成，屬于四環三萜達瑪烷類皂甙，由異戊二烯單元(5碳)組成的化合物(見化學結構簡式)，到目前為止，從植物人參中已分離并確定了結構的皂甙成分計40余種，近年來，通過對單體皂甙成分的藥理活性深入研究，發現各單體皂甙均具有不可替代的重要藥用價值。??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????人參皂甙的化學結構

我國第一個擁有自主知識產權的中藥單體抗癌一類新藥“參一膠囊”，就是從人參中提取的抗癌成分—人參皂甙單體Rg3。人參皂甙單體Rh2亦具有較強的抗腫瘤活性，人參皂甙Rg1和Rb1是抗衰老的主要活性成分和最有希望的抗衰老先導化合物。但由于各人參皂甙單體在人參中含量甚微如抗腫瘤轉移療效明顯的Rg3僅為十萬分之三，而且提取制備極其復雜昂貴，再加之人參皂甙化學結構及合成工藝十分復雜，致使人參皂甙仍不能化學全合成。目前主要靠從含量甚低的栽培人參中提取少量人參皂甙，但難以滿足巨大臨床用藥的需求。因而，植物人參中人參皂甙含量甚微已成為制約人參皂甙單體新藥開發的瓶頸。

發明內容

本發明應用現代分子生物學新技術如抑制消減雜交(SSH)等方法，從藥用植物人參中克隆出促人參皂甙生物合成相關新基因。并通過轉基因生物反應器生產人參皂甙，提高人參植物中包括Rg3、Rb1、Rg1等在內的人參皂甙單體生物合成量及顯著縮短其生物合成周期，以滿足日益增長的臨床治療用藥市場的需求。

本發明根據人參植物的生物學特性，即一年生人參根人參皂甙含量極微，第四年急劇增加，以后隨著年齡的增加，人參皂甙含量變化不大的人參皂甙產生的生長發育階段特異性，以四年生人參根組織作為切入點，率先應用mRNA差異顯示-抑制消減雜交(suppression?subtractive?hybridization，SSH)(Diatchenko?L，等.Proc?Natl?Acad?Sci?USA，93：6025-6030，1996)等新技術，通過比較四年和一年生人參根組織基因表達譜，經兩輪分子雜交和兩輪PCR擴增后，構建了四年生人參根組織差異表達的cDNA文庫，該文庫被亞克隆入T載體，通過陽性克隆篩選，酶切鑒定、反向Northern斑點分子雜交、DNA測序及GenBank數據庫同源性比較分析等確認，首次從四年生人參植物根組織中克隆出六個新的人參皂甙生物合成相關基因，分別被命名為GBR₁、GBR₂、GBR₃、GBR₄、GBR₅、GBR₆；美國國家生物技術中心(NCBI)的國際GenBank數據庫登錄號分別為AF485334，AF485335，AF485336，AF485337，AF485332，AF485333，其DNA全長序列分別為145bp，227bp，291bp，400bp，421bp和1049bp，采用Northern分子雜交進一步鑒定上述新基因是否為全長cDNA序列。不是全長序列的DNA片段，應用cDNA快速末端擴增法(rapid?amplification?of?cDNA?ends，RACE)(Frohman?MA，等.Proc.NatlAcad.Sci.USA，85：8998-9002，1988)，獲取其全長基因序列，構建原核融合蛋白表達載體，進行原核表達蛋白及其生物學特性分析，同時進一步構建含有促人參皂甙生物合成相關新基因的高效植物表達轉化載體，應用既穩定可靠又可減少植物轉基因沉默發生的成熟的具Ri二元質粒的發根農桿菌(A.rhizogenes)基因轉化系統，遺傳轉化人參懸浮培養細胞。利用比較植物功能基因組學研究新技術即通過氣相色譜-質譜聯用(gas?chromatography-massspectrometry，GC/MS)法(Fiehn?O，等.NatBiotechnol，18(11)：1157-6118，2000Nov)直接定量測定并比較分析轉基因人參發根培養系中人參皂甙化學成分譜表型的改變，明確六個新基因在調控人參皂甙生物合成中的功能作用，即上述新基因為促進何種人參皂甙單體生物合成的功能基因，為植物基因工程生產人參皂甙及人參品質改良奠定基礎，可最終建立提高人參組織細胞中包括Rg3、Rb1、Rg1等在內的人參皂甙單體生物合成量和顯著縮短其生物合成周期的新生產途徑。