[發(fā)明專利]結(jié)核分枝桿菌診斷檢測(cè)試劑

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 02113890.7
• 申請(qǐng)日: 2002-06-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN1388378A
• 公開(kāi)（公告）日: 2003-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鮑朗;曾獻(xiàn)武;趙明才
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569;G01N33/96;G01N33/563;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.技術(shù)領(lǐng)域??本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)免疫診斷學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是關(guān)于一種結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)試劑盒及其在臨床結(jié)核病的診斷中的應(yīng)用。

2.發(fā)明背景??結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種傳染性疾病，曾在全球出現(xiàn)過(guò)大流行。隨著有效的抗結(jié)核藥物的問(wèn)世，結(jié)核病流行情況出現(xiàn)好轉(zhuǎn)。但是，近十余年來(lái)由于結(jié)核桿菌多重耐藥性菌株的出現(xiàn)、HIV與結(jié)核桿菌伴發(fā)感染以及人口流動(dòng)的增加等原因，結(jié)核病疫情再度回升，全球結(jié)核病形勢(shì)出現(xiàn)了惡化趨勢(shì)。1993年WHO宣布“結(jié)核病全球緊急狀態(tài)”，1998年WHO又重申遏制結(jié)核病的行動(dòng)刻不容緩。目前全世界約有20億人受到結(jié)核桿菌感染，現(xiàn)有2000萬(wàn)結(jié)核病人，其中95％在發(fā)展中國(guó)家。每年新發(fā)病人數(shù)為800-1000萬(wàn)，死亡人數(shù)約300萬(wàn)，已超過(guò)艾滋病、瘧疾、腹瀉、熱帶病死亡人數(shù)的總和。我國(guó)的結(jié)核病流行情況也一直十分嚴(yán)重，是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，根據(jù)2000年進(jìn)行的第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果估算，我國(guó)約有450萬(wàn)活動(dòng)性肺結(jié)核病人，結(jié)核病人數(shù)位居世界第二位，約占全球結(jié)核病人的四分之一，傳染性肺結(jié)核病人約150萬(wàn)，每年約有12.7萬(wàn)人死于結(jié)核病。結(jié)核病已成為當(dāng)今威脅人類健康的主要全球性疾病之一，也是由單一傳染因子導(dǎo)致死亡的最常見(jiàn)原因。降低結(jié)核病死亡率的關(guān)鍵是早期診斷，從而能準(zhǔn)確及時(shí)的制訂合理、科學(xué)的治療方案。

目前結(jié)核病診斷的主要手段有病原菌的涂片染色鏡檢和分離培養(yǎng)、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)以及血清學(xué)檢測(cè)等。涂片染色鏡檢法是基于結(jié)核桿菌的抗酸染色特性達(dá)到檢定的目的，但該法存在靈敏度低、特異性差的缺點(diǎn)。分離培養(yǎng)法檢查往往需4-8周或更長(zhǎng)的時(shí)間，常延誤臨床的診斷和治療。結(jié)核菌純蛋白衍生物(PPD)是目前廣泛應(yīng)用于結(jié)核病診斷的試劑，但由于PPD中含有許多分枝桿菌屬(包括致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌和卡介苗)所共有的抗原分子，因此PPD診斷結(jié)核病的特異性差，不能準(zhǔn)確區(qū)分PPD試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性究竟是因?yàn)榻臃N卡介苗、與環(huán)境中多種非結(jié)核性分枝桿菌接觸后造成的致敏還是真正的結(jié)核桿菌感染所致。血清學(xué)檢測(cè)方法具有快速、簡(jiǎn)便、便于推廣，無(wú)需特殊精密儀器的特點(diǎn)是一種非常有潛力的結(jié)核病診斷手段，但是當(dāng)前所用的診斷抗原(如PPD、38KD、30KD、14KD、19KD蛋白等)存在著特異性較差、假陽(yáng)性率高的缺點(diǎn)，急需一種具有較強(qiáng)特異性及免疫原性的診斷抗原。

結(jié)核分枝桿菌ESAT-6作為一種低分子量分泌性抗原蛋白，在結(jié)核桿菌感染早期即由細(xì)菌分泌產(chǎn)生，并被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別。結(jié)核桿菌ESAT-6抗原蛋白分子表位眾多(有B細(xì)胞表位、CD₄⁺、CD₈⁺T細(xì)胞表位以及DTH表位)，且僅在致病性分枝桿菌中表達(dá)，而不存在于卡介苗及其它非致病性分枝桿菌中，因而是一種極有前景的結(jié)核病特異診斷抗原。CFP-10也是一種分泌性抗原，編碼CFP-10的基因與ESAT-6相鄰，處于同一操縱子中，均位于結(jié)核分枝桿菌基因組的RD1區(qū)段，在卡介苗中同樣缺失。聯(lián)用ESAT-6與CFP-10診斷結(jié)核菌感染，能提高檢測(cè)的敏感性和特異性。

3.發(fā)明內(nèi)容??本發(fā)明通過(guò)基因工程手段，將結(jié)核分枝桿菌ESAT-6和CFP-10蛋白在體外表達(dá)、純化、并制備結(jié)核分枝桿菌的抗體及抗原檢測(cè)試劑盒；以及將ESAT-6和CFP-10融合表達(dá)所產(chǎn)生的融合蛋白經(jīng)純化后，制備結(jié)核分枝桿菌的抗體及抗原檢測(cè)試劑盒。該試劑盒能特異性地檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的抗體及抗原，能區(qū)分是因?yàn)榻臃N卡介苗、以及與環(huán)境中多種非結(jié)核性分枝桿菌接觸后造成的致敏還是真正的結(jié)核分枝桿菌感染，可用于結(jié)核病的臨床血清學(xué)診斷。

4.具體實(shí)施方式1)以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組序列為模板，分別設(shè)計(jì)ESAT-6和CFP-10基因的引物，克??隆ESAT-6和CFP-10基因。2)通過(guò)基因工程手段，將克隆的ESAT-6和CFP-10基因末端加上連接肽段，獲得融合蛋白??基因。3)將各克隆基因轉(zhuǎn)入表達(dá)載體，表達(dá)相應(yīng)蛋白，通過(guò)凝膠電泳及Western?Blotting進(jìn)行鑒??定分析。4)采用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白分離純化技術(shù)，純化各表達(dá)蛋白。如：離心、離子交換層析、疏水層析、??親和層析等。5)各表達(dá)蛋白采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫程序免疫動(dòng)物，如：家兔、豚鼠、山羊等。制備二種相應(yīng)的??抗體，并純化其IgG。6)經(jīng)方陣滴定，確定包被抗原(檢測(cè)蛋白)的濃度，并配備其他相關(guān)試劑，制備結(jié)核分枝??桿菌抗體ELISA檢測(cè)(間接法)試劑盒。7)經(jīng)方陣滴定，確定包被抗體(檢測(cè)蛋白抗體)、第二抗體(酶標(biāo)檢測(cè)蛋白抗體)的濃度，??并配備其他相關(guān)試劑，制備結(jié)核分枝桿菌抗原ELISA檢測(cè)(雙抗體夾心法)試劑盒。

實(shí)施例實(shí)施例1：ELISA間接法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗體取待檢血清樣品0.1ml，加入已包被有融合蛋白抗原的酶標(biāo)板中，37℃孵育30分鐘，每塊板設(shè)三孔陰性對(duì)照，二孔陽(yáng)性對(duì)照，一孔空白對(duì)照。孵育結(jié)束，棄去板孔中的液體，用洗滌液洗板五次，扣干。加入抗人IgG酶標(biāo)抗體，充分混勻，37℃孵育30分鐘。同上洗板后，加入顯色液0.1ml，輕拍混勻，37℃避光顯色30分鐘。每孔加入終止液一滴，輕拍混勻，用450nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)讀OD值，判定結(jié)果。實(shí)施例2：ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗原取待檢血清樣品0.1ml，加入已包被有融合蛋白抗體(第一抗體)的酶標(biāo)板中，37℃孵育30分鐘，每塊板設(shè)三孔陰性對(duì)照，二孔陽(yáng)性對(duì)照，一孔空白對(duì)照。孵育結(jié)束，棄去板孔中的液體，用洗滌液洗板五次，扣干。加入第二抗體(兔抗融合蛋白抗體)，充分混勻，37℃孵育30分鐘。同上洗板后加入抗兔IgG酶標(biāo)抗體，充分混勻，37℃孵育30分鐘。洗板，加入顯色液0.1ml，輕拍混勻，37℃避光顯色30分鐘。每孔加入終止液一滴，輕拍混勻，用450nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)讀OD值，判定結(jié)果。