[發明專利]耐高溫磷酸甘油酸變位酶1基因及其編碼的多肽和制備方法

無效

• 申請號: 02111364.5
• 申請日: 2002-04-12
• 公開（公告）號: CN1379097A
• 公開（公告）日: 2002-11-13
• 發明（設計）人: 李蔚;于軍;張小英;王俊;孫建冬
• 申請（專利權）人: 杭州華大基因研發中心
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/63;C12N15/64;C12N9/00;//;C12R101)
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 張法高

??????????????????????????技術領域

本發明涉及突變或遺傳工程，尤其涉及一種耐高溫磷酸甘油酸變位酶1基因及其編碼的多肽和制備方法。

??????????????????????????背景技術

磷酸甘油酸變位酶1(phosphoglycerate?mutase?1)又名2，3-二磷酸-D-甘油酸：2-磷酸-D-甘油酸磷酸轉移酶。它是一種參與能量代謝中糖酵解和糖質新生過程的酶。其作用是催化磷酰從3-磷酸甘油酸的C₃移至C₂。Mg²⁺在催化反應中是必須的。在該反應中，2，3-二磷酸甘油酸是因子，其反應的機理是從2，3-二磷酸甘油酸將2-磷酸基轉移到一分子2-磷酸甘油酸，再生成另外一分子2，3-二磷酸甘油酸及2-磷酸甘油酸。磷酸甘油酸變位酶1的編碼基因為GpmA。

磷酸甘油酸變位酶與二磷酸甘油酸變位酶是結構相似的兩種酶，它們的作用都是催化磷酸甘油酸上的三個碳原子上的磷酸基的轉移。這兩種酶都可以催化以下這三種不同的反應：第一個反應是以2，3-二磷酸甘油酸為引物，2-磷酸甘油酸(2-PGA)異構化生成3-磷酸甘油酸；第二個反應是以3磷酸甘油酸為引物，1，3-二磷酸甘油酸合成為2，3-二磷酸甘油酸。第三個反應是2，3-二磷酸甘油酸脫磷酸生成3-磷酸甘油酸。

在哺乳動物中，磷酸甘油酸變位酶是一個二聚體的蛋白。該酶有兩種類型的，一種為M(肌肉型)，和B型(腦型)。在酵母中，該酶是一個四聚體蛋白質。磷酸甘油變位酶和二磷酸甘油酶的的催化作用機制會伴隨著一個磷酸組氨酸介質的生成。

在糖分解過程中起作用的磷酸甘油酸變位酶在自然界以兩種在進化上無甚關聯的形式存在。在脊椎動物中只有2，3-二磷酸甘油酸依賴型酶(dPGM)，而在高等植物中卻只有輔助因子-非依賴型酶(iPGM)。而一些真細菌則擁有編碼這兩種酶的基因。

因此磷酸甘油酸變位酶1在農業生產、工業生產及醫藥業具有廣泛的應用前景。

本發明涉及的騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter?tangcongensis)，是生活在我國云南省騰沖縣的熱泉中的一種微生物，是一種嗜熱的真細菌(eubacteria)，最適生長溫度為75攝氏度，厭氧生長，革蘭氏染色反應呈陽性。它是由中國科學院微生物所首先發現并進行了分類學上的分析。菌種保存在中國微生物保存中心MB4^T(Chinese?collection?of?microorganisms?AS?1.2430^T＝JCM?11007^T)。該嗜熱厭氧菌是我國特有的一個物種，其體內所具有的耐高溫磷酸甘油酸變位酶1也具有自己特有的結構。

??????????????????????????發明內容

本發明的目的之一是提供一種分離的，編碼具有耐高溫磷酸甘油酸變位酶1活性的多肽的核苷酸序列。

本發明的目的之二是提供一種分離的，具有耐高溫磷酸甘油酸變位酶1活性多肽。

本發明的目的還提供了含有編碼耐高溫磷酸甘油酸變位酶1的DNA的重組載體、含有前述重組載體的宿主細胞，以及生產該蛋白的方法。

本發明的第一方面提供了一種編碼具有耐高溫磷酸甘油酸變位酶1活性的多肽的核苷酸序列。該核苷酸序列能編碼具有SEQ?ID?NO.2中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式，該修飾形式功能上相當或與磷酸甘油酸變位酶1相關。核苷酸序列具有SEQ?ID?NO.1的多核苷酸序列以及它的突變形式，突變類型包括：缺失、無義、插入、錯義。

本發明的第二方面提供了一種耐高溫磷酸甘油酸變位酶1活性的多肽。該多肽具有SEQ?ID?NO.2中的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

本發明還提供了生產耐高溫磷酸甘油酸變位酶1的方法：

1)分離出編碼耐高溫磷酸甘油酸變位酶1的基因的核苷酸序列SEQ?IDNO.1；

2)構建含SEQ?ID?NO.1核苷酸序列的表達載體；

3)將步驟2)中表達載體轉入宿主細胞，形成能生產耐高溫磷酸甘油酸變位酶1的重組細胞；

4)培養步驟3)中的重組細胞；

5)分離、純化得到耐高溫磷酸甘油酸變位酶1。